基本概念
質粒zhìlì（Plasmid）是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區DNA原有的能夠自主複制的較小的DNA分子（即細胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的質粒雖然都是環狀構型，它存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的葉綠體和線粒體等胞器中。然而，1984年，在 Streptomyces coelicoler（天藍色鍊黴菌）等放線菌以及在 Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋體）等原核生物中，又相繼發現線形質粒。
天然質粒的DNA長度從數千堿基對至數十萬堿基對都有。質粒天然存在于這些生物裡面，有時候一個細胞裡面可以同時有一種乃至于數種的質粒同時存在。質粒的套數（copy number）在細胞裡從單一到數千都有可能。有時有些質粒含有某種抗藥基因（如大腸杆菌中就有含有抗四環素基因的質粒）。有一些質粒攜帶的基因則可以賦予細胞額外的生理代謝能力，乃至于在一些細菌中提高它的緻病力。一般來說，質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的作用。它是基因工程最常見的運載體。
分類
質粒大緻可分為5類，見下表：
*抗各種抗生素，抗重金屬離子（汞，镉，鎳，钴，鋅，砷）
質粒根據它們所帶有的基因以及賦于宿主細胞的特點可以分為六種不同的類型：
1、抗性質粒：它們帶有抗性基因，可使宿主菌對某些抗菌素産生抗性，如對氨基苄青黴素，氯黴素等産生抗性。不同的細菌中也可含有相同的抗性質粒，如RP4質粒在假單胞菌屬和其它細菌中都存在。R質粒還可以通過感染的形式在不同種的細菌中傳播。
2、緻育因子：可以通過接合在供體和受體間傳遞遺傳物質。F因子約有1/3的DNA構成一個轉移DNA的操縱子，約35個基因，負責合成和裝配性傘毛。這就是DNA轉移區域，受traJ基因産物的正調節。它還具有重組區和複制區。重組區含有多個插入順序，通過這些插入順序進行同源重組。在複制區有兩個複制起始點：一個是OriV，供給F因子在宿主中自主複制時使用；另一個是OriT，供接合時進行滾環複制的起始點。
3、Col質粒：帶有編碼大腸杆菌素的基因。大腸杆菌素可殺死其它細菌。
4、降解質粒：這種質粒編碼一種特殊蛋白，可使宿主菌代謝特殊的分子，如甲苯或水楊酸。
5、侵入性質粒：這些質粒使宿主菌具有緻病的能力。如Ti質粒，此是在根癌農杆菌中發現的，現經過加工用來作植物轉基因的一種常用載體。
6、隐秘質粒：不顯示任何表現類型，主要通過物理方法才能發現。
細胞複制
質粒在細胞内的複制一般有兩種類型：緊密控制型（Stringent control）和松弛控制型（Relaxed control）。前者隻在細胞周期的一定階段進行複制，當染色體不複制時，它也不能複制，通常每個細胞内隻含有一個或幾個質粒分子，如F因子。後者的質粒在整個細胞周期中随時可以複制，在每個細胞中有許多拷貝，一般在20個以上，如 Col E1質粒。在使用蛋白質合成抑制劑-氯黴素時，細胞内蛋白質合成、染色體DNA複制和細胞分裂均受到抑制，緊密型質粒複制停止，而松弛型質粒繼續複制。
質粒拷貝數可由原來20多個擴增至1000-3000個，此時質粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。利用同一複制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質粒同時導入同一細胞時，它們在複制及随後分配到子細胞的過程中彼此競争，在一些細胞中，一種質粒占優勢，而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代後，占少數的質粒将會丢失，因而在細胞後代中隻有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性（Incompatibility）。
質粒載體
把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體（Vector）。細菌質粒是重組DNA技術中常用的載體。質粒分子本身是含有複制功能的遺傳結構。質粒還帶有某些遺傳信息，所以會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。其自我複制能力及所攜帶的遺傳信息在重組DNA操作，如擴增、篩選過程中都是極為有用的。
質粒載體是在天然質粒的基礎上為适應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質粒相比，質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性标記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性内切酶識别位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、産生用于序列測定的單鍊DNA、體外轉錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。
一個理想的克隆載體大緻應有下列一些特性：⑴分子量小、多拷貝、松弛控制型；⑵具有多種常用的限制性内切酶的單切點；⑶能插入較大的外源DNA片段；⑷具有兩個以上的遺傳标記物，便于鑒定和篩選。⑸對宿主細胞無害。常用的質粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列、PET系列和pBluescript（簡稱pBS）等。
不兼容性
利用同一複制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質粒同時導入同一細胞時,它們在複制及随後分配到子細胞的過程中彼此競争。在一些細胞中，一種質粒占優勢，而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代後，占少數的質粒将會丢失，因而在細胞後代中隻有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同複制系統的質粒則可以穩定地共存于同一宿主細胞中。質粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包括對抗生素的抗性，産生某些抗生素，降解複雜有機物，産生大腸杆菌素和腸毒素及某些限制性内切酶與修飾酶等。
提取方法
從細菌中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。采用強堿液、加熱或溶菌酶（主要針對革蘭氏陽性細菌）可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS或 Triton X-100處理後，細菌染色體DNA會纏繞附着在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。
當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡稱cccDNA）的兩條鍊不會相互分開，當外界條件恢複正常時，線狀染色體DNA片段難以複性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鍊又恢複原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀态存在于液相中。在細菌細胞内，共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會産生其它形式的質粒DNA。
如果質粒DNA兩條鍊中有一條鍊發生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鍊的張力，形成松弛型的環狀分子，稱開環DNA(Open circularDNA，簡稱ocDNA）；如果質粒DNA的兩條鍊在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA）。當提取的質粒DNA電泳時，同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。
分離操作
從細菌中分離質粒DNA的具體操作
材料設備試劑
一、材料
含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管（又稱eppendorf管），離心管架。
二、設備
微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器（滅菌鍋），渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平闆電泳裝置和恒溫水浴鍋等。
三、試劑
1、LB液體培養基（Luria-Bertani）：稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。
2、LB固體培養基：液體培養基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。
3、氨苄青黴素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存備用。
4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分裝成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一經使用後便予丢棄。
5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸調pH至5.2，加水定容至100ml，分裝後高壓滅菌，儲存于4℃冰箱。
6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1%SDS。
8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻後用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20℃。
10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些産物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導緻RNA和DNA的交聯，應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉（作為抗氧化劑），并用等體積的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/LTris·Cl（pH8.0）緩沖液反複抽提使之飽和并使其pH值達到7.6以上，因為酸性條件下DNA會分配于有機相。
11、氯仿：按氯仿：異戊醇=24：1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。按體積/體積=1：1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。
12、TE緩沖液：10mmo/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高壓滅菌後儲存于4℃冰箱中。
13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。
14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。
15、電泳所用試劑：⑴TBE緩沖液（5×）：稱取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。⑵上樣緩沖液（6×）：0.25%溴酚藍，40%（w/v）蔗糖水溶液。
操作步驟
一、細菌的培養和收集
将含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養基（含50μg/mlAmp）中，37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養基（含50μg/mlAmp）中，37℃振蕩培養約12小時至對數生長後期。
二、質粒DNA少量快速提取
質粒DNA小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
（一）、煮沸法
1、将1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000轉離心30秒。
2、棄上清，将管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3、将菌體沉澱懸浮于120mlSTET溶液中，渦旋混勻。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），渦旋振蕩3秒鐘。
5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒後立即取出。
6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。
7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
8、取20ml進行電泳檢查。
[注意]1.對大腸杆菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的質粒DNA中會含有RNA，但RNA并不幹擾進一步實驗，如限制性内切酶消化，亞克隆及連接反應等。
（二）、堿法
1、取1.5ml培養液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。
2、棄上清，将管倒置于衛生紙上數分鐘，使液體流盡。
3、菌體沉澱重懸浮于100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振蕩），室溫下放置5-10分鐘。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和颠倒eppendorf管數次，以混勻内容物（千萬不要振蕩），冰浴5分鐘。
5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒，使沉澱混勻，冰浴中5-10分鐘，4℃下12000g離心5-10分鐘。
6、上清液移入幹淨eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿（1:1），振蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。
7、将水相移入幹淨eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻後置于-20℃冰箱中20分鐘，然後4℃下12000g離心10分鐘。
8、棄上清，将管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出，加入1ml70%乙醇洗沉澱一次，4℃下12000g離心5-10分鐘。
9、吸除上清液，将管倒置于衛生紙上使液體流盡，真空幹燥10分鐘或室溫幹燥。
10、将沉澱溶于20μlTE緩沖液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，儲于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取過程應盡量保持低溫。2.提取質粒DNA過程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，要将蛋白盡量除幹淨需多次抽提。3.沉澱DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉澱完全。沉澱DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉澱完全，速度快，但常把鹽沉澱下來，所以多數還是用乙醇。
（三）、Wizard少量DNA純化系統
Promega公司的Wizard少量DNA純化系統可快速有效的抽提質粒DNA，整個過程隻需15分鐘。提取的質粒可直接用于DNA測序、酶切分析和體外轉錄等。該系統中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50mlWizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml）和50支Wizard微型柱。
1、1-3ml過夜培養細胞液4℃下12000g離心1-2分鐘。
2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl細胞懸浮液中，充分混合，并移入eppendorf管中。
3、加200μl細胞裂解液，颠倒離心管數次，直到溶液變清亮。
4、加200μl中和液，颠倒離心管數次。
5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。
6、加1mlWizard少量DNA純化樹脂，颠倒離心管數次以充分混勻。
7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍将上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進入微型柱。
8、将注射器與微型柱分開，取出注塞，再将注射筒與微型柱相連，加入2ml柱洗液，并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf管中，離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
10、将微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μlTE（或水）于微型柱中，靜止1分鐘後，4℃下12000g離心20秒。
11、丢棄微型柱，将eppendorf管中的質粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。
[注意]樹脂使用前應充分混勻，如有結晶，可将樹脂用25-37℃水浴處理10分鐘。
三、質粒DNA的大量提取和純化在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA，為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
（一）、堿法
1、取培養至對數生長後期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g離心15分鐘，棄上清，将離心管倒置使上清液全部流盡。
2、将細菌沉澱重新懸浮于50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。
3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
4、将細菌沉澱物重新懸浮于5ml溶液I中，充分懸浮菌體細胞。
5、加入12ml新配制的溶液Ⅱ，蓋緊瓶蓋，緩緩地颠倒離心管數次，以充分混勻内容物，冰浴10分鐘。6、加9ml用冰預冷的溶液Ⅲ，搖動離心管數次以混勻内容物，冰上放置15分鐘，此時應形成白色絮狀沉澱。
7、4℃下5000g離心15分鐘。
8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml），37℃水浴20分鐘。
9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。
10、取上層水相，加入等體積氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。
11、取上層水相，加入1/5體積的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60分鐘。
12、4℃下12000g離心15分鐘，沉澱用數ml70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
13、真空抽幹沉澱，溶于500mlTE或水中。
[注意]1.提取過程中應盡量保持低溫。2.加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ後操作應混和，切忌劇烈振蕩。3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應先對該酶液進行熱處理（80℃1小時），使DNA酶失活。
（二）、Wazard大量DNA純化系統
堿法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統既簡單又快速，隻需要離心和真空抽幹，這個系統可以從500ml培養液中在3小時以内獲得1mg以上的高質量的質粒DNA（200-20000bp）。該系統不需要酚和氯仿抽提，純化後的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。
該系統中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括：150ml細胞懸浮液，150ml細胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量DNA純化樹脂，125mlWizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲離心管的柱子。
1、100-500ml細胞培養液置離心管中，22-25℃下5000g離心10分鐘，所得細胞沉澱充分懸浮于細胞懸浮液中。
2、加15ml細胞裂解溶液并輕輕混合，可以反複倒置混合，但不能用渦旋振蕩，細胞裂解完全時，溶液會變清，這一步需要20分鐘。
3、加15ml中和溶液，立即反複倒置離心管數次，并使之混勻。
4、14000g，22-25℃離心15分鐘。
5、小心地将上清液吸出并移至一個新離心管中。
6、加0.5倍體積的異丙醇，混合均勻，14000g22-25℃下離心15分鐘。
7、棄上清，懸浮DNA沉澱于2mlTE緩沖液中。這一步中也許有的沉澱不能溶解。
8、加10mlWizard大量DNA純化樹脂溶液，并渦旋混合。
9、每一個樣品，使用一支Wizard大量柱子，柱子的頭插在真空器上（Promega産品，與此配套）。
10、将樹脂/DNA混合液轉入柱子中，真空抽取樹脂/DNA混合液。
11、将樹脂/DNA混合液抽幹後，加13ml柱子洗脫溶液至離心管中，對管底部的樹脂/DNA進行洗脫（柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液），并加入柱子中。
12、真空抽幹所加入的洗脫。
13、再加12ml柱子洗脫液進柱子并抽幹。
14、加入5ml80%乙醇漂洗柱中的樹脂，柱子真空抽幹後将柱子放入用戶提供的離心管
中，2500rpm（1300g）離心5分鐘。
15、取出柱子，真空抽幹5分鐘，再将柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm（1300g）離心5分鐘。
16、在柱子中加入1.5ml65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE，1分鐘後2500rpm（1300g）離心柱子/離心管5分鐘。
17、取出柱子，離心管中溶液即為提取的質粒DNA，可以直接放在離心管中，蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。
[注意]1.在使用之前，系統所提供的柱子洗脫液按1：1加入125ml95%乙醇。2.純化樹脂必須混勻後再用.
（三）、Sephrose2B柱純化質粒DNA
堿法提取的質粒DNA即使用RNA酶處理，仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA污染的DNA制品時，則需進行進一步純化。一般常用Sepharose2B或Sepharose4B進行純化，該方法具有快速，條件溫和，重複性好，載體物質可以再利用等優點，因而已廣泛用于質粒DNA純化。
1、将Sepharose2B經含0.1%SDS的TE（pH8.0）平衡後上柱。
2、将至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase2B柱上。
3、待DNA溶液完全進入柱内後立即在柱的上部連接含有0.1%SDS的TE（pH8.0）貯液瓶。
4、以1ml流出液為1份進行收集。
5、對每一管測定其OD260值，以确定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA在柱上流出的第一個峰中。
6、合并所有含質粒的洗脫液，用等體積的酚/氯仿（1:1）抽提，4℃下12000g離心2分鐘，将上層水相轉入新管。
7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉澱10分鐘，然後4℃下12000g離心10分鐘，棄去上清液。
8、沉澱加70%乙醇洗滌，4℃下12000g離心10分鐘，棄去上清液。
9、沉澱真空抽幹，重新溶于TE或無菌水中。
[注意]在裝柱過程中，要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象，要使界面保持平整。對新裝成的柱，應用含0.1%SDS的TE平衡，以使柱内的凝膠均勻。
複制特性
質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌拟核DNA之外，并具有自我複制能力的很小的雙鍊環狀DNA分子。在基因工程中質粒常被用做目的基因的載體(Vector）。質粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中。攜帶外源DNA片段的質粒進入受體細胞後，在細胞中進行自我複制，或整合到染色體DNA上，随染色體DNA同步複制。質粒DNA分子上有特殊的标記基因，如四環素抗性基因，氨苄青黴素抗性基因等标記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。
已發現有質粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀DNA分子（簡稱cccDNA）。細菌質粒的相對分子質量一般較小，約為細菌拟核的0.5%～3%。根據相對分子質量的大小，大緻上可以把質粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質量是40×106以上，較小一類的相對分子質量是10×106以下（少數質粒的相對分子質量介于兩者之間）。
每個細胞中的質粒數主要決定于質粒本身的複制特性。按照複制性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體複制一次時，質粒也複制一次，每個細胞内隻有1～2個質粒；另一類是松弛型質粒，當染色體複制停止後仍然能繼續複制，每一個細胞内一般有20個左右質粒。
這些質粒的複制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還會使質粒拷貝數增至幾千份。如較早的質粒pBR322即屬于松弛型質粒，要經過氯黴素處理才能達到更高拷貝數。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型。分子量較小的質粒屬松弛型。質粒的複制有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸杆菌内的複制屬嚴緊型，而在變形杆菌内則屬松弛型。
培養
在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。人工構建的質粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環素基因（Tcr）和抗氨苄青黴素基因（Apr），并含有27種限制性内切酶的單一識别位點。
如果将DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果将DNA片段插入到HindⅢ、BamHI或SalI切點，就會使抗四環素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主細菌抗氨苄青黴素，但對四環素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨苄青黴素又抗四環素，而沒有pBR322質粒的細菌将對氨苄青黴素和四環素都敏感。pSC101與pBR322相似，隻是沒有抗氨苄青黴素基因和PstI切點。質粒運載體的最大插入片段約為10kb(kb表示為千堿基對）。
1973年，科學家将質粒作為基因的載體使用，為基因工程的誕生奠定了基礎。
最常用的質粒是大腸杆菌的質粒。這種質粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那黴素抗性基因。
pBR322質粒
pBR322質粒DNA分子的長度為4361bp*（*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.），此載體中有兩個标記基因，一個是氨苄青黴素抗性基因（Apr），另一個是四環素抗性基因（Tetr）。
已知pBR322DNA分子共有24種核酸内切限制酶的單一識别位點。其中7種限制酶（從12：00位置按順時針方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaⅢ和NruI的識别位點位于四環素抗性基因内部，另外有2種限制酶即ClaI和HindⅢ的識别位點是存在于這個基因的啟動區内，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導緻tetr的失活。
3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識别位點位于氨苄青黴素抗性基因内，在這些位點插入外源DNA則會導緻ampr基因的失活。由pBR322質粒載體的結構可知其具有如下優點：⑴具有較小的分子量。經驗表明，為了避免在DNA的純化過程中發生鍊的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。
pBR322質粒這種小分子量的特點，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；⑵具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記号，能指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。标記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型，這種轉化細胞可明顯地區别于非轉化細胞。
當我們把一個DNA片段插入到某一個标記基因内時，該基因就失去了相應的功能。當把這種重組DNA分子轉到宿主細胞後，該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉化細胞，細胞内含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那麼這種載體必須至少具有兩個标記基因。另外，pBR322質粒載體還具較高的拷貝數，而且經過氯黴素擴增之後，每個細胞中可積累1000~3000個拷貝，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。
載體構建
pBR322質粒載體的構建過程可簡單地概括如下：
1、由于pBR322質粒的親本之一是pMB1質粒，故首先以pMB1為基礎，引入Rldrd19質粒的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3質粒；
2、pMB3的分子量顯然使得它不适合作為載體，所以要通過在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無用片段失去，留下來的小片段的DNA的黏性末端連接起來後就形成了pMB8質粒（2.6kb）；
3、此時，另外一種pSC101質粒在EcoRI活性條件下消化産生了含有tetr抗性的DNA片斷，這個片斷和pMB8整合在一起就形成了pMB9質粒（5.3kb）。此時pMB9為ampstetr表型；
4、pMB9已經初步具備載體的功能，為了讓它更加完善，我們要讓它具備amprtetr性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以來也可以走，為了留住它，我們切去了Tn3中表達轉位酶的基因，形成了pBR313質粒。
此後我們兵分兩路：一路把pBR313的PstI位點除去，使之成為ampstetr表型的pBR318質粒；
5、；另一路把pBR313的EcoRⅡ的位點切除，使之成為amprtets表形的pBR320質粒。
由此我們的到了兩種功能互補的質粒，這樣我們隻要将他們雜交就可以得到一種接近全能的載體質粒了，這就是pBR322。
應用技術
了解了pBR322的結構和它的構建過程之後，我們來看pBR322在基因工程中的應用。
pBR322質粒作為一種常用的基因克隆載體，在實際應用中有着非常重要的地位，其中一個突出的例子就是應用pBR322作為克隆載體對水稻的葉綠體光誘導基因psbA進行結構分析。
将水稻葉綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性内切酶消化之後，放入含有溴化乙錠的低熔點（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.8～2.5kb之間的DNA片段，再與同樣經過了EcoRI核酸限制性内切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質粒連接。
然後，将混合物轉化到大腸杆菌5346菌株，培養在氨苄青黴素選擇平闆上，形成Ampr轉化子菌落群體。這樣就構成了由EcoRI核酸限制性内切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫。用Ampr轉化子菌落與32P放射性标記的玉米psbADNA探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質粒DNA，經過進一步的分析，就能測出水稻葉綠體基因psbA的序列。
利用pBR322作為載體重組人體的抑生長激素也是一個經常提到的應用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小異，隻是除了在質粒載體上插入抑生長激素基因外，還将含有lac操縱子起始部分的片段（包括啟動子、操縱區、核糖體結合位點和β－半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生長激素基因的旁邊。由于有了lac操縱子的控制，重組基因産生的蛋白質的調節就變得比較容易了。
