蛋白質純化:生物化學術語-中文百科頻道

一般原則

蛋白純化要利用不同蛋白間内在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染，而利用各蛋白質的差異将目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異，利用這些差異可将蛋白從混合物如大腸杆菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。

蛋白的純化大緻分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。一般蛋白純化采用的方法為樹脂法。粗分離階段主要将目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開，由于此時樣本體積大、成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬．并可以迅速将蛋白與污染物分開，必要時可加入相應的保護劑（例如蛋白酶抑制劑），防止目的蛋白被降解。

精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質接近的蛋白區分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應用時要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個從樹脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

程序

分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為前處理、粗分級、細分級三步。

前處理

分離純化某種蛋白質，首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀态釋放出來并保持原來的天然狀态，不丢失生物活性。為此，動物材料應先剔除結締組織和脂肪組織，種子材料應先去殼甚至去種皮以免受單甯等物質的污染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然後根據不同的情況，選擇适當的方法，将組織和細胞破碎。

動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。

細菌細胞的破碎比較麻煩，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎後，選擇适當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法将它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然後用适當介質提取。

粗分離

當蛋白質提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得後，選用一套适當的方法，将所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不适于用沉澱或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空幹燥或其他方法進行濃縮。

細分離

樣品經粗分級分離以後，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最後的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規模較小，但分辨率很高。

結晶是蛋白質分離純化的最後步驟。盡管結晶過程并不能保證蛋白一定是均一的，但是隻有某種蛋白在溶液中數量上占有優勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴随着一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結晶過程中從未發現過變性蛋白，因此蛋白的結晶不僅是純度的一個标志，也是斷定制品處于天然狀态的有力指标。

離子層析法

蛋白純化離子交換層析法有劑和離子交換劑當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，随後用改變pH或辦法将吸附的蛋白質洗脫下來。

有機溶劑提取

蛋白質純化有機溶劑提取的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯着降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。

例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。由于在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴随着變性。

因此,通常要将有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對于一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鍊較多、不溶于水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。

冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是WHO規程和中國生物制品規程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時分離多種成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。

藥物分離

一、根據蛋白質溶解度不同的分離

1、蛋白質的鹽析法：中性鹽對蛋白質的溶解度有顯着影響，一般在低鹽濃度下随着鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先後析出，這種現象稱鹽析。

2、等電點沉澱法：蛋白質在靜電狀态時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差别，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。

二、根據蛋白質分子大小的差别的分離方法

1、透析與超濾：透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的泸膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法：也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

三、根據蛋白質帶電性質進行分離

1、電泳法：各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法：離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，随後用改變pH或離子強度辦法将吸附的蛋白質洗脫下來。

四、根據配體特異性的分離方法－親和色譜法

親和層析法（aflinitychromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常隻需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很複雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。

其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以複雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從複雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往采取幾種方法聯合使用。