基本原理
薄層色譜，英文簡稱TLC，也叫薄層層析，因分離是在一平面薄層上進行的，得名薄層色譜。薄層色譜是以合适的溶劑為流動相，以塗布于支持闆上的支持物作為固定相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術。薄層色譜是20世紀40年代末發展起來的一種快速、簡便和微量的色譜方法。
薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在流動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續的産生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。
薄層層析可根據作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑）、薄層分配層析（纖維素）、薄層離子交換層析（離子交換劑）、薄層凝膠層析（分子篩凝膠）等。一般實驗中應用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。
吸附是表面的一個重要性質。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質或溶解于其中的溶質在此表面上的密集現象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發生吸附現象。
物質分子之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子（離子或原子）和固體内部分子所受的吸引力不相等。在固體内部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。
而處于固體表面的分子所受的力是不對稱的，向内的一面受到固體内部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩餘力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間内被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間内離開此表面的分子之間可以建立動态平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地産生平衡與不平衡、吸附與解吸的動态平衡過程。
例如用矽膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數的不同，使混合物得以分離。當溶劑沿着吸附劑移動時，帶着樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與解吸作用以及反複分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終将混合物分離成一系列斑點。如作為标準的化合物在層析薄闆上一起展開，則可以根據這些已知化合物的Rf值（後面介紹Rf值）對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步采用某些方法加以定量。
遷移值
Rf=溶質移動的距離/溶液移動的距離。表示物質移動的相對距離。
各種物質的Rf随要分離化合物的結構，濾紙或薄層闆的種類、溶劑、溫度等不同而不同，但在條件固定的情況下，Rf對每一種化合物來說是一個特定數值。
儀器與材料
載闆
用以塗布薄層用的載闆有玻璃闆、鋁箔及塑料闆，對薄層闆的要求是：需要有一定的機械強度及化學惰性，且厚度均勻、表面平整，因此玻璃闆是最常用的。載闆可以有不同規格，但最大不得超過20×20，玻璃闆在使用前必須洗淨、幹燥備用。玻闆除另有規定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規格，要求光滑、平整，洗淨後不附水珠，晾幹。
固定相（吸附劑）或載體
薄層層析矽膠薄層層析矽膠最常用的有矽膠G、矽膠GF、矽膠H、矽膠HF，其次有矽藻土、矽藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F等。其顆粒大小，一般要求直徑為10～40μm。薄層塗布，一般可分無粘合劑和含粘合劑兩種；前者系将固定相直接塗布于玻璃闆上，後者系在固定相中加入一定量的粘合劑，一般常用10～15%煅石膏（CaSO4.2H2O在140℃烘4小時），混勻後加水适量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液（0.5～0.7%）适量調成糊狀，均勻塗布于玻璃闆上。也有含一定固定相或緩沖液的薄層。
塗布器
應能使固定相或載體在玻璃闆上塗成一層符合厚度要求的均勻薄層。
點樣器
定性：内徑為0.5mm管口平整的普通毛細管。
定量：微量注射劑。
點樣直徑不超過5mm，點樣距離一般為1~1.5cm即可。
展開室
應使用适合載闆大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴密的蓋子，除另有規定外，底部應平整光滑，應便于觀察。
操作
薄層闆制備
除另有規定外，将1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡後，倒入塗布器中，在玻闆上平穩地移動塗布器進行塗布（厚度為0.2～0.3mm），取下塗好薄層的玻闆，置水平台上于室溫下晾幹，後在110℃烘30分鐘，即置有幹燥劑的幹燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。
手工制闆一般分不含粘合劑的軟闆和含粘合劑的硬闆倆種。
常用吸附劑的基本情況：顆粒的大小，太大洗脫劑流速快分離效果不好，太細溶液流速太慢。一般說來吸附性強的顆粒稍大，吸附性弱的顆粒稍小。氧化鋁一般在100-150目。氧化鋁分為堿性氧化鋁，适用于碳氫化合物、生物堿及堿性化合物的分離，一般适用于PH為9-10的環境。中性氧化鋁适用于醛、酮、醌、酯等PH約為7.5的中性物質的分離。酸性氧化鋁适用于PH4~4.5的酸性有機酸類的分離。氧化鋁、矽膠根據活性分為五個級，一級活性最高，五級最低。
黏合劑及添加劑：為了使固定相（吸附劑）牢固地附着在載闆上以增加薄層的機械強度，有利于操作，需要時在吸附劑中加入合适的黏合劑：有時為了特殊的分離或檢出需要，要在固定相中加入某些添加劑。
薄層闆的活化：矽膠闆于105-110℃烘30分鐘，氧化鋁闆于150-160℃烘4小時，可得活性的薄層闆。
點樣
除另有規定外，用點樣器點樣于薄層闆上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑及點間距離同紙色譜法，點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。點樣直徑不超過5mm，點樣距離一般為1~1.5cm即可。
樣品在溶劑中的溶解度很大，原點将呈空心環——環形色譜效應。因此配制樣品溶液時應選擇對組分溶解度相對較小的溶劑。點樣方式有點狀點樣和帶狀點樣。
展開
展開劑也稱溶劑系統，流動性或洗脫劑，是在平面色譜中用作流動相的液體。展開劑的主要任務是溶解被分離的物質，在吸附劑薄層上轉移被分離物質，使各組分的Rf值在0.2~0.8之間并對被分離物質要有适當的選擇性。作為展開劑的溶劑應滿足以下要求：适當的純度、适當的穩定性、低黏度、線性分配等溫線、很低或很高的蒸氣壓以及盡可能低的毒性。
展開方式總的來講平面色譜的展開有線性、環形及向心3種幾何形式。
A、單次展開用同一種展開劑一個方向展開一次，這種方式在平面色譜中應用最為廣泛。（垂直上行展開，垂直下行展開，一向水平展開，對向水平展開）
B、多次展開單向對此展開，用相同的展開劑沿同一方向進行相同距離的重複展開，直至分離滿意，廣泛應用于薄層色譜法。
C、雙向展開用于成分較多、性質比較接近的難分離組分的分離。
薄層展開室需預先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂的蓋，使系統平衡或按正文規定操作。将點好樣品的薄層闆放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層闆底邊0.5～1.0cm（切勿将樣點浸入展開劑中），密封室蓋，待展開至規定距離（一般為10～15cm），取出薄層闆，晾幹，按各品種項下的規定檢測。
影響展開的因素：
A、相對濕度的影響；
B、溶劑蒸汽的影響（a展開室的飽和b預吸附）；
C、溫度的影響；
D、展距的影響與分離度僅正比與展距的平方根。
顯色
光學檢出法
a、自然光（400~800nm）
b、紫外光（254nm或365nm）
c、熒光一些化合物吸收了較短波長的光，在瞬間發射出比照射光波長更長的光，而在紙或薄層上顯出不同顔色的熒光斑點（靈敏度高、專屬性高）
蒸汽顯色法
多數有機化合物吸附碘蒸氣後顯示不同程度的黃褐色斑點，這種反應有可逆及不可逆兩種情況，前者在離開碘蒸氣後，黃褐色斑點逐漸消退，并且不會改變化合物的性質，且靈敏度也很高，故是定位時常用的方法；後者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強了共轭體系，因此在紫外光下可以發出強烈而穩定的熒光，對定性及定量都非常有利，但是制備薄層時要注意被分離的化合物是否改變了原來的性質。
物理顯色法
用紫外照射分離後的紙或薄層後，使化合物産生光加成，光分解、光氧化還原及光異構等光化學反應，導緻物質結構發生某些變化，如形成熒光發射功能團。發生熒光增強或淬滅及熒光物質的激發或發射波長發生移動等現象，從而提高了分析的靈敏度和選擇性。
試劑顯色法
廣泛應用的定位方法。用于紙色譜的顯色劑一般都适用于薄層色譜，還有防腐劑的顯色劑不适合用于紙色譜及含有有機黏合劑薄層的顯色，又時噴顯色劑後續加熱，這也不是用于紙色譜。
顯色方法：
a、噴霧顯色：顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在紙和薄層。
b、浸漬顯色：揮去展開劑的薄層闆，垂直的插入盛有展開劑的浸漬槽中，設定浸闆及抽出速度和規定在顯色劑中浸漬的時間。
應用
食品和營養
食品中的營養成分是蛋白質、氨基酸、糖類、油和脂肪、維生素、食用色素等。與食品和營養有害的物質則有殘留農藥、緻癌的黃曲黴素等。這些成分都可用薄層色譜法定性和定量。蛋白質和多肽水解為氨基酸，對不同來源的動物性和植物性蛋白水解後産生不同的氨基酸進行定性和定量，有助于解決蛋白質的結構和食品營養問題。
二十多種氨基酸用矽膠G薄層闆雙向展開，一次即能分開，然後定性和定量，方法快速而簡便。多糖和寡糖可水解為單糖，可用薄層色譜法進行單糖和雙糖的定性和定量。文獻上有每一個糖的Rf值和相應的展開劑。油和脂肪解為脂肪酸，脂肪酸的種類和結構中的不飽和鍵數，與營養和衛生有關，關于油和脂肪的薄層（矽膠、矽藻土、纖維素）分析，文獻和綜述很多。
脂溶性和水溶性維生素在薄層上可方便地定性和定量，例如脂溶性維生素A，D，E，K及B2，B6，B12，酶酸，泛酸，葉酸，C，促生素在矽膠G薄層上可用苯：甲醇：丙酮：冰醋酸（7:2:0.5:0.5）分開。用矽膠G薄層和丙酮：氯仿（1:1）以及激發波長365nm和波長450nm，可用熒光法測定ng量的曲黃素B1,B2,G1,G2，法靈敏快速。
藥物和藥物代謝
薄層色譜法在合成藥物和天然藥物中的應用很廣。有些文獻和内容偏重于合成藥物、化合物及其代謝産物，有文獻為在中草藥分析中的應用。每一類藥物，例如磺胺、巴比妥、苯骈噻嗪、甾體激素、抗菌素、生物堿、強心甙、黃酮、揮發油和萜等，都包括幾種或十幾種化學結構和性質非常相似的化合物，可以在上述文獻中找出一、二種全盤的展開劑，一次即能把每一類的多種化合物很好地分開。藥物代謝産物的樣品一般先經預處理後用薄層分析，應用也很廣，但有時因含量甚微，不用采用氣相和高效液相色譜法靈敏。
化學和化工
化工和化學方面的有機原料和産品都可用薄層色譜法分析。例如含各種功能基的有機物，石油産品，塑料單體，橡膠裂解産物，油漆原料，合成洗滌劑等，内容非常廣泛。
醫學和臨床
薄層色譜法的應用還滲透到醫學和臨床中去，例如它是一種快速的診斷方法可用于妊娠的早期診斷。方法是基于在孕婦的尿中能檢出比未媳婦婦女的尿中含更多的孕二醇，把兩者的尿提取後點在薄層上比較，即可作出判斷。這一方法可不用動物而在2~3小時内化驗出結果。
毒物分析和法醫化學
如前所述，經典的毒物分析有許多缺點，毒物分析和法醫化學采用薄層色譜法等新的手段，對麻醉藥、巴比妥、印度大麻、鴉片生物堿等均可分析。
農藥
十多種有機磷農藥和六種有機氯農藥都可在矽膠G薄層上分開并測定含量，可用于農藥分析及其殘留量分析。
優缺點
薄層層析有許多優點：它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需15～20分鐘；混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10～100倍，它既适用于隻有0．01μg的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。
