發現
siRNA最早是由英國的大衛·包孔博(David Baulcombe)團隊發現,是植物中的後轉錄基因沉默(post-transcriptional gene silencing;PTGS)現象的一部分,其研究結果發表于《科學》。2001年,湯瑪士·塗許爾(Thomas Tuschl)團隊發現合成的siRNA,可誘導哺乳動物體内的RNAi作用,結果發表于《科學》。這項發現引發了利用可控制的RNAi,來進行生物醫學研究與藥物開發的方法。
結構
siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙股RNA(dsRNA),其兩股分别在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸,圖示如下:
每一股各有一個5'磷酸基末端與一個3'羟基末端。此結構是利用一種稱為dicer的酶處理而得,這種酶可以将較長的雙股RNA或小發夾RNA(small hairpin RNA)切成siRNA。此外,siRNA也可經由多種不同轉染(transfection)技術導入細胞内,并對特定基因産生具專一性的敲弱(knockdown)效果。因此可利用經過适當剪裁的siRNA之互補性,來對已知序列的基因進行标定,這種現象使siRNA成為研究基因功能與藥物目标的一項重要工具。
siRNA機制
1.長dsRNA(可來自發夾,互補RNA和RNA依賴性RNA聚合酶)被稱為Dicer的内切核糖核酸酶切割。Dicer切割長dsRNA以形成短幹擾RNA或siRNA;這使得分子能夠形成RNA誘導的沉默複合物(RISC)。
2.一旦siRNA進入細胞,它就會被整合到其他蛋白質中以形成RISC。
3.一旦siRNA是RISC複合物的一部分,siRNA就展開以形成單鍊siRNA。
4.由于其在5'末端的堿基配對而在熱力學上較不穩定的鍊被選擇作為RISC複合物的一部分。
5.作為RISC複合物一部分的單鍊siRNA現在可以掃描并找到互補的mRNA
6.一旦單鍊siRNA(RISC複合物的一部分)與其靶mRNA結合,它就會誘導mRNA切割。
7.現在切割mRNA并被細胞識别為異常。這導緻mRNA的降解,并且反過來不将mRNA翻譯成氨基酸然後轉化為蛋白質。從而沉默編碼該mRNA的基因。
siRNA也類似于miRNA,然而,miRNA來自較短的莖環RNA産物,通常通過抑制翻譯來沉默基因,并且具有更廣泛的作用特異性,而siRNA通常通過在翻譯前切割mRNA而起作用,并且具有100%的互補性,因此目标特異性非常嚴格。
用siRNA或其生物合成前體RNAi
通過轉染外源siRNA進行的基因敲低通常是不令人滿意的,因為該效應僅是短暫的,特别是在快速分裂的細胞中。這可以通過産生siRNA的表達載體來克服。修飾siRNA序列以在兩條鍊之間引入短環。得到的轉錄物是短發夾RNA(shRNA),其可以通過Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的轉錄盒使用RNA聚合酶III啟動子(例如,U6或H1)來指導小核RNA(snRNA)的轉錄(U6參與基因剪接;H1是RNase)人RNase P的成分。理論上,所得的siRNA轉錄物然後由Dicer處理。
通過使用細胞擠壓也可以提高基因敲低效率。
RNAi中siRNA的活性很大程度上取決于其與RNA誘導的沉默複合物(RISC)的結合能力。雙鍊體siRNA與RISC的結合之後是用内切核酸酶解開和切割有義鍊。然後剩餘的反義鍊-RISC複合物可以與靶mRNA結合以啟動轉錄沉默。
RNA激活
已經發現dsRNA還可以激活基因表達,這種機制被稱為“小RNA誘導的基因激活”或RNAa。已經顯示靶向基因啟動子的dsRNA誘導相關基因的有效轉錄激活。使用合成的dsRNA在人細胞中證明RNAa,稱為“小活化RNA”(saRNA)。尚不清楚RNAa是否在其他生物體中是保守的。