发现
siRNA最早是由英国的大卫·包孔博(David Baulcombe)团队发现,是植物中的后转录基因沉默(post-transcriptional gene silencing;PTGS)现象的一部分,其研究结果发表于《科学》。2001年,汤玛士·涂许尔(Thomas Tuschl)团队发现合成的siRNA,可诱导哺乳动物体内的RNAi作用,结果发表于《科学》。这项发现引发了利用可控制的RNAi,来进行生物医学研究与药物开发的方法。
结构
siRNA通常是一段长21个核苷酸的双股RNA(dsRNA),其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸,图示如下:
每一股各有一个5'磷酸基末端与一个3'羟基末端。此结构是利用一种称为dicer的酶处理而得,这种酶可以将较长的双股RNA或小发夹RNA(small hairpin RNA)切成siRNA。此外,siRNA也可经由多种不同转染(transfection)技术导入细胞内,并对特定基因产生具专一性的敲弱(knockdown)效果。因此可利用经过适当剪裁的siRNA之互补性,来对已知序列的基因进行标定,这种现象使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。
siRNA机制
1.长dsRNA(可来自发夹,互补RNA和RNA依赖性RNA聚合酶)被称为Dicer的内切核糖核酸酶切割。Dicer切割长dsRNA以形成短干扰RNA或siRNA;这使得分子能够形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。
2.一旦siRNA进入细胞,它就会被整合到其他蛋白质中以形成RISC。
3.一旦siRNA是RISC复合物的一部分,siRNA就展开以形成单链siRNA。
4.由于其在5'末端的碱基配对而在热力学上较不稳定的链被选择作为RISC复合物的一部分。
5.作为RISC复合物一部分的单链siRNA现在可以扫描并找到互补的mRNA
6.一旦单链siRNA(RISC复合物的一部分)与其靶mRNA结合,它就会诱导mRNA切割。
7.现在切割mRNA并被细胞识别为异常。这导致mRNA的降解,并且反过来不将mRNA翻译成氨基酸然后转化为蛋白质。从而沉默编码该mRNA的基因。
siRNA也类似于miRNA,然而,miRNA来自较短的茎环RNA产物,通常通过抑制翻译来沉默基因,并且具有更广泛的作用特异性,而siRNA通常通过在翻译前切割mRNA而起作用,并且具有100%的互补性,因此目标特异性非常严格。
用siRNA或其生物合成前体RNAi
通过转染外源siRNA进行的基因敲低通常是不令人满意的,因为该效应仅是短暂的,特别是在快速分裂的细胞中。这可以通过产生siRNA的表达载体来克服。修饰siRNA序列以在两条链之间引入短环。得到的转录物是短发夹RNA(shRNA),其可以通过Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的转录盒使用RNA聚合酶III启动子(例如,U6或H1)来指导小核RNA(snRNA)的转录(U6参与基因剪接;H1是RNase)人RNase P的成分。理论上,所得的siRNA转录物然后由Dicer处理。
通过使用细胞挤压也可以提高基因敲低效率。
RNAi中siRNA的活性很大程度上取决于其与RNA诱导的沉默复合物(RISC)的结合能力。双链体siRNA与RISC的结合之后是用内切核酸酶解开和切割有义链。然后剩余的反义链-RISC复合物可以与靶mRNA结合以启动转录沉默。
RNA激活
已经发现dsRNA还可以激活基因表达,这种机制被称为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa。已经显示靶向基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录激活。使用合成的dsRNA在人细胞中证明RNAa,称为“小活化RNA”(saRNA)。尚不清楚RNAa是否在其他生物体中是保守的。