定義
按作用原理分類
1、吸附柱色譜法
2、分配柱色譜法
3、離子交換柱色譜法
4、凝膠柱色譜法
基本用途
液相色譜儀對高沸點、難氣化合物的混合物通過色譜柱核淋洗劑并以實現分離。
使用範圍
應用于生物醫學、環境化學、石油化工等部門。
工作原理
系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）内，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反複多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上産生較大的差别，被分離成單個組分依次從柱内流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信号傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面将分别叙述其各自的組成與特點。
進樣系統
一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重複性是有益的。
輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X10Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存器和梯度儀，可使流動相随固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競争性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差别或是同分異構體）都能獲得有效分離。
分離系統
該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），内徑為2～5mm，由"優質不鏽鋼或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或矽膠構成，它們都有惰性（如矽膠表面的矽酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各種長度碳鍊的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性矽膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀态，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區内傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔闆理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理。
再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
應用
高效液相色譜法隻要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發性的限制，流動相可選擇的範圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩定和非揮發性的、離解的和非離解的以及各種分子量範圍的物質。與試樣預處理技術相配合，HPLC所達到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能，能夠分離複雜相體中的微量成分。随着固定相的發展，有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。
由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反複利用，流出組分易收集等優點，因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發展方向。液相色譜-質譜連用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜連用也發展很快如在環境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發烴類，使環境污染分析得到新的發展。
安裝
1、液相色譜柱的結構：
a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。柱接頭采用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3/16英寸的内螺紋(國内外已規範化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的内螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環後要盡量插到底，然後再擰緊空心螺釘。壓環被空心螺釘擠壓變形後緊箍在連接管上(連接管通過壓環後露出的管長度應嚴格控制在2．5mm長或其他固定尺寸)。在兩端柱接頭内，柱管兩端各放置一片不鏽鋼濾片(或濾網)，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316#不鏽鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管内不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
b、柱填料：液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據填料類型而定。正相柱：多以矽膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10µm的範圍内。另一類正相填料是矽膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相矽膠。反相柱：主要是以矽膠為基質，在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10µm之間。
2、色譜柱的安裝：
a、拆開柱包裝盒，确認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱内貯存的溶劑。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
c、按柱管上标示的流動相流向，将色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、内徑為0.1-0.3mm的不鏽鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環後盡量用力插到底，然後順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，再用扳手繼續順時針擰1/4-1/2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓後有漏液現象，請用扳手繼續順時針擰1/4圈，直至不漏液為止。
故障處理
氣泡溢出
流動相内有氣泡，關閉泵，打開洩壓閥，打開purg鍵，清洗脫氣，氣泡不斷從過濾器冒出，進入流動相，無論打開purge鍵幾次，都無法清除不斷産生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸铵等緩沖液内,過濾器内部由于黴菌的生長繁殖，形成菌團，阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可将過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時，輕輕震蕩幾次，再将過濾器用純水清洗幾次，打開洩壓閥，打開purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過濾器冒出，繼續将過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出，說明過濾器内部的黴菌菌團已被硝酸破壞，流動相可以流暢地通過過濾器。打開洩壓閥，打開泵，流速調至1.0～3.0ml/min，純水沖洗過濾器1小時左右。即可将過濾器清洗幹淨。關閉洩壓閥，純甲醇沖洗半小時即可。
柱壓高
⑴緩沖液鹽分如（乙酸铵等）沉積于柱内；
⑵樣品污染沉積。
處理對于第一種情況先用40～50℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降後，相應提高流速沖洗，柱壓大幅度下降後，用常溫純水沖洗，之後用純甲醇沖洗柱子30分鐘；對于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，換成甲醇沖洗，接着用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子，再用換成甲醇沖洗，然後用純水沖洗，最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
無指示
⑴泵密封墊圈磨損；
⑵大量氣泡進入泵體。
處理對于第一種情況，更換密封墊圈；對于第二種情況，在泵作用的同時，用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
不穩定
原因系統中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量，保證不鏽鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
峰分叉
⑴色譜柱被污染；
⑵柱頭填料塌陷。
處理對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然後換成甲醇沖洗，接着用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定），再換成甲醇沖洗，然後用純水沖洗，最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗後依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分（污染的填料），裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱内徑相同的頂端平滑的不鏽鋼杆壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反複幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗幹淨，擦淨柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。
重複性差
⑴進樣閥漏液；
⑵加樣針不到位；
⑶液量不足。
處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈；對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液後須快速、平穩地從LOAD狀态轉換到INJECT狀态，以保證進樣量的準确。日常工作中，液相色譜儀的保養非常重要，注意不要讓空氣進入輸液系統和高壓泵中，儲液器内的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀後緩沖液要用純水沖洗幹淨，防止無機鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質，完全溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜柱的使用壽命，同時避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進樣閥内析出固體引起堵塞；色譜柱作好标記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
