结构特点
内皮抑素是1997年O’Reilly等从培养的小鼠内皮细胞瘤(EOMA)上清中分离纯化的一种内源性血管生成抑制剂,为20kd分子量蛋白质。内皮抑素是胶原18的降解产物,降解过程至少包括两步酶解,参与酶解的可能有弹性蛋白酶、组织蛋白酶L和基质金属蛋白酶。
进一步晶体结构分析发现:内皮抑素结构表面有一由11个精氨酸残基组成的碱性区域,为肝素结合位点,这解释了内皮抑素对肝素的高亲和力特性,也可能是通过该区域与血管生成因子竞争结合肝素,起到抑制血管生成作用。但也有研究表明内皮抑素与血管壁的结合不依赖于肝素结合位点,且与FGF-2无竞争性抑制作用。
此外,在内皮抑素序列中发现由其N端第1,3,11位3个组氨酸及第76位的天冬氨酸残基组成的锌离子结合位点,锌与内皮抑素的N端环绕形成一个二聚体结构。最初认为内皮抑素与锌离子结合对其抗血管生成活性很重要,但后来通过基因修饰方法去除锌离子结合位点的研究表明,内皮抑素抑制内皮细胞的迁移及肿瘤的生长并不依赖锌离子结合位点。
生物学功能
内皮抑素对血管内皮细胞的抑制作用内皮抑素能特异性抑制血管内皮细胞在bFGF诱导下的增殖,抑制内皮细胞的迁移,诱导内皮细胞凋亡,但对非内皮细胞,如平滑肌细胞、3T3成纤维细胞、Lewis肺癌细胞等均无抑制作用。Kim等研究也证明,内皮抑素能抑制人脐静脉内皮细胞穿透人工基底膜的能力,且与抑制效果呈剂量依赖关系。
内皮抑素对血管生成的抑制作用目前,多种实验都能证实内皮抑素对生长的血管产生抑制作用,而对静止的血管组织不起作用。O’Reilly等通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,用大肠杆菌或杆状病毒表达的内皮抑素均显示出对鸡胚血管生成有明显抑制作用,且未见毒性反应。
Bloch等研究证明内皮抑素并不影响小鼠伤口愈合、伤口收缩、伤口感染及伤口上皮再生,但能减少肉芽组织的形成。Yin等将携带内皮抑素基因的重组慢病毒注入由TNF诱导的小鼠初期类风湿性关节炎的关节内,结果显示内皮抑素可抑制关
节内血管生成及血管翳的形成,减缓类风湿性关节炎的进展。说明内皮抑素不仅可以抑制肿瘤血管新生,对病理性血管性炎症也有抑制作用。
内皮抑素对肿瘤生长和转移的抑制作用国内外许多学者利用重组内皮抑素蛋白或通过内皮抑素基因治疗实验表明,内皮抑素对多种实体瘤的生长和转移都能产生抑制作用。
Bohen用鼠重组内皮抑素几乎完全抑制小鼠Lewis肺癌、黑素瘤、纤维素瘤、血管内皮瘤、肾细胞癌等原发灶肿瘤的生长,治疗6周期后肿瘤进入休眠期,停药后肿瘤无复发,且未见转移灶发生,不产生耐药性。同时在细胞水平,也有实验证明内皮抑素能抑制肿瘤细胞在人工基底膜凝胶中的迁移。Perletti等利用二甲基苯并蒽(DMBA)诱发的大鼠乳腺癌动物模型,连续4周每天皮下注射内皮抑素20mg/ kg ,使肿瘤停药后4周仍处于休眠状态,表明内皮抑素对原发肿瘤也有明显抑制作用。
内皮抑素的作用机制
目前,内皮抑素抗血管生成治疗已经取得惊人的效果,但其作用机制尚未完全阐明,
其可能的作用机制主要有:
①通过下调β-连环素(β-catenin)的转录活性,抑制周期蛋白D1的表达,引起内皮细胞G1期阻滞;
②下调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达,诱导内皮细胞凋亡;
③与基质金属蛋白酶2前体蛋白(pro-MMP2)结合形成稳定复合体,阻止proMMP2的激活,并抑制MMP2和MMP1的催化活性,从而抑制内皮细胞的迁移;
④与原肌球蛋白结合,破坏微丝结构的完整性,使细胞运动功能丧失,诱导凋亡;
⑤抑制c-myc表达而抑制内皮细胞迁移;
⑥通过肝素结合位点与内皮细胞表面的接头蛋白Shb受体的SH2区域结合,激活酪氨酸激酶信号转导系统,导致内皮细胞G1期阻滞,诱导内皮细胞凋亡;
⑦整合素α5β1在调节bFGF诱导的血管生成中起重要作用,内皮抑素可以和整合素α5β1直接结合,影响内皮细胞同细胞外基质的黏附,抑制内皮细胞的迁移和生长;
⑧抑制VEGF受体KDR/Flk-1酪氨酸磷酸化,从而抑制VEGF与内皮细胞的结合,抑制VEGF诱导的细胞外信号调节激酶ERK活性。
内皮抑素抗肿瘤血管生成治疗的研究
直接使用重组内皮抑素蛋白
目前重组内皮抑素基因工程表达系统主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统表达量高,但产物多以包涵体形式存在,不可溶解,难以复性,造成应用不便,虽然经过蛋白重新折叠可溶,但此过程会损失大量蛋白。哺乳动物细胞的表达产物活性高,但是表达量低,难以纯化。
而用酵母表达产量高,易于纯化,活性高,特别是毕赤酵母表达系统被广泛地应用于内皮抑素的表达,目前美国用于I期临床试验的内皮抑素就是毕赤酵母的表达产物。O’Reilly等利用大肠杆菌表达的内皮抑素注入荷瘤小鼠体内,2. 5 mg/ kg使Lewis肺癌移植瘤体积缩小53 % ,10mg/kg则瘤体体积缩小97% ,增至20mg/kg,原发瘤几乎完全萎缩,而0. 3 mg/ (kg·d)的内皮抑素就能完全抑制Lewis肺癌转移灶的生长。
通过载体转导内皮抑素基因
通过适当载体转导内皮抑素基因,使其在体内长期、稳定表达生物活性高的内皮抑素,有效地弥补了蛋白治疗的不足。已证实质粒、脂质体、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒及慢病毒等都是有效的载体。相对非病毒载体,应用病毒载体转染后可获得更高的内皮抑素血浆浓度。Feld2man等将表达内皮抑素的腺病毒重组体经尾静脉注入MC38腺癌小鼠体内,小鼠血浆内皮抑素浓度高达1770ng/ml,使相对不易感染腺病毒的MC38腺癌抑制率仍达40%。
其他治疗方法
Joki等将内皮抑素基因转导到某些细胞内,再将这种可分泌内皮抑素的细胞用藻酸盐包裹成微胶囊,注入大脑内后细胞可抵御机体排斥和组织中酶的消化,持续分泌一定有效浓度的内皮抑素,并有效地抑制了神经胶质瘤的生长。同样,通过微量泵持续给药的方法也能使体内内皮抑素的浓度保持稳定,抑瘤效果明显强于间断给药。
国内学者徐根兴等利用青春双歧杆菌作载体,将内皮抑素基因导入双歧杆菌后注入肿瘤小鼠尾静脉内,检验发现只在实体瘤中存在青春双歧杆菌,而其他正常组织未见青春双歧杆菌,同时也高效地抑制了肿瘤的生长和血管新生。而且他们还用转人内皮抑素基因双歧杆菌制成口服制剂,经多例晚期实体肿瘤志愿者临床试验证明,其对肝癌、胃癌、肠癌、肺癌等实体肿瘤的治疗有较好的抑瘤效果。
问题与展望
内皮抑素从发现到进入目前Ⅱ期临床试验,短短数年时间,取得的进展令世人倍受鼓舞。实验表明内皮抑素特异性抑制血管内皮细胞作用肯定,对多种依赖血管生成的实体瘤都有抑制作用,且无耐药性和明显毒副作用,为肿瘤的临床治疗开辟了一条新路。随着内皮抑素作用机制的完全阐明,及如何大规模的生产、纯化高效有活性的重组内皮抑素蛋白,如何延长内皮抑素在体内的半衰期,如何选择安全高效的合适载体来进行基因治疗,如何正确地选择适应症和治疗对象等这一系列问题的解决,相信内皮抑素对肿瘤的抗血管生成治疗将有更大的应用前景。
