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原則
1、引物最好在模闆cDNA的保守區内設計。
DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較确定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
引物長度（primer length）常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導緻其延伸溫度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶進行反應。n
3、引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）過高或過低都不利于引發反應。上下遊引物的GC含量不能相差太大。另外，上下遊引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鍊溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鍊解鍊的溫度。n有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使複性條件最佳。n
4、引物3′端要避開密碼子的第3位。
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。n
5、引物3′端不能選擇A，最好選擇T。
引物3′端錯配時，不同堿基引發效率存在着很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鍊的合成，而當末位鍊為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。n
6、堿基要随機分布。
引物序列在模闆内應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導緻錯誤引發（False priming）。n降低引物與模闆相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是随機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。n
7、引物自身及引物之間不應存在互補序列。
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身複性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模闆的複性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。n兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。n引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導緻産生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。n
8、引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。
△G值是指DNA雙鍊形成所需的自由能，它反映了雙鍊結構内部堿基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鍊越穩定。應當選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鍊結構并引發DNA聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進行分析）n
9、引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。
引物的5′端決定着PCR産物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；标記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。n引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。n
10、擴增産物的單鍊不能形成二級結構。
某些引物無效的主要原因是擴增産物單鍊二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模闆。n實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。n
11、引物應具有特異性。
引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。n值得一提的是，各種模闆的引物設計難度不一。有的模闆本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導緻找不到各種指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因為産物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況隻能退而求其次，盡量去滿足條件。
