loading buffer

loading buffer

化學術語
loading buffer的中文名字叫上樣緩沖液,6*的緩沖液中可以顯示兩條帶,前面的紫蘭色的條帶是溴酚藍,在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中,溴酚蘭的遷移率分别與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鍊線性DNA片段大緻相同;後面的蘭色條帶是二甲苯青,它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時,其遷移速率分别與2Kb和1.6Kb的雙鍊線性DNA大緻相似。而對于PAGE膠他們的遷移速率也分别不同。[1]
  • 中文名:上樣緩沖液
  • 外文名:loading buffer
  • 配制量:5mL
  • 配制方法:5×SDS-PAGE Loading Buffer

主要用途

loading buffer的功能主要有兩個。第一,裡邊的指示劑溴酚藍和二甲氰FF起到指示的作用,顯示電泳進程,以便我們适時終止電泳;第二,裡邊的成分甘油可以加大樣品密度,使樣品密度大于TAE,從而沉降到點樣孔中,防止樣品飄出點樣孔。另外,有的Buffer是加有SDS的,一般都會寫明。SDS主要是促使聚合酶變性,因為沒有除盡的聚合酶會結合在DNA雙鍊上影響它的遷移速率。細胞裂解後的裂解液,加loading 100℃加熱,也是為了中止酶促反應,防止提取的蛋白質降解。

制備方法

6×loading buffer 一般配置:

6×Loading buffer:

30mM EDTA

36%(v/v) Glycerol

0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.05%(w/v) Bromophenol Blue

主要用于DNA電泳:

10×Loading buffer:

30mM EDTA

50%(v/v) Glycerol

0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.25%(w/v) Bromophenol Blue

主要用于RNA電泳:

10X loading buffer中僅有色素溴酚藍(Bromophenol Blue)一種染料(濃度0.05%);

6X loading buffer中含色素溴酚藍(Bromophenol Blue)、二甲苯腈藍FF(Xylene Cyanol FF)兩種染料(濃度都是0.05%)

瓊脂糖凝膠(0.5% ~ 1.4%)中溴酚藍(Bromophenol Blue)約與300 bp的雙鍊線狀DNA的遷移速度相同,二甲苯腈藍FF則與4kbp的雙鍊線狀DNA的遷移速度相等。

6Xloading buffer是用來上樣的;10Xloading buffer是stop buffer,是停止酶促反應的,如果一定要用10Xloading buffer的上樣當然也可以,唯一要注意的是:10Xloading buffer中多了一樣SDS,它會使酶類如taq酶變性,以PCR産物為例,在電泳泳道上會産生一片彌散,如果電泳跑的距離短,和多出來一條帶沒有什麼區别(大概1000bp左右)。

5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法

組份濃度:

250mM Tris-HCl(pH6.8)

10%(W/V)SDS

0.5%(W/V)BPB

50%(V/V)甘油

5%(W/V)β-巯基乙醇

配制量: 5mL

配制方法:

1.量取下列試劑,置于10mL塑料離心管中。

1M Tris-HCl 1.25mL

SDS 0.5g

BPB 25mg

甘油 2.5mL

2.加入去離子水溶解後定容至5mL。

3.小份(500μl/份)分裝後,于室溫保存。

4.使用前将25μl的2-ME加到每小份中。

5.加入2-ME的Loading Buffer可在室溫下保存一個月左右。

相關詞條

相關搜索

其它詞條