基本介紹
染色質免疫共沉澱技術(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也稱結合位點分析法,是研究體内蛋白質與DNA相互作用的有力工具,通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。将ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術,能夠高效地在全基因組範圍内檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。
ChIP-Seq的原理是:首先通過染色質免疫共沉澱技術(ChIP)特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,并對其進行純化與文庫構建;然後對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過将獲得的數百萬條序列标簽精确定位到基因組上,從而獲得全基因組範圍内與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段信息。
技術路線
實驗流程
(1)甲醛交聯整個細胞系(組織),即将目标蛋白與染色質連結起來;
(2)分離基因組DNA,并用超聲波将其打斷成一定長度的小片段;
(3)添加與目标蛋白質特異的抗體,該抗體與目标蛋白形成免疫沉澱免疫結合複合體;
(4)去交聯,純化DNA即得到染色質免疫沉澱的DNA樣本,準備測序;
(5)将準備好的樣本進行深度測序。
生物信息分析流程
(1)将測序得到的短序列片段匹配到參考基因組序列上。
(2)有一部分短序列不能匹配到參考基因組上,有可能是未知的基因組序列;另一部分是能夠匹配到基因組上的短序列,通常要對這些短序列進行複蓋度計算。
(3)從匹配到基因組上的短序列中進行富集區域的掃描。通常掃描到的富集區即被認為是蛋白質與DNA相互結合的區域(也有假陽性位點等的影響)。
(4)對掃描到的富集區做深度分析,包括基因,GO注釋,利用基因浏覽器進行可視化浏覽,研究與基因結構的關系等。
研究内容
測序
對客戶提供的ChIP樣品(如果有陰陽參啟動子區域或DNA序列的)進行定量檢測,檢測合格後進行測序文庫構建、DNA成簇(Cluster generation)擴增、高通量測序。
基本數據分析
數據産出統計:對測序結果進行圖像識别(Base calling),去除污染及接頭序列;統計結果包括:測定的序列(Reads)長度、Reads數量、數據産量。
高級數據分析
标準高級數據分析内容包括:
(1)ChIP-Seq序列與參考序列比對;
(2)Peak calling:統計樣品Peak信息(峰檢測及計數、平均峰長度、峰長中位數);
(3)統計樣品Uniquely mapped reads在基因上、基因間區的分布情況及複蓋深度;
(4)給出每個樣品Peak關聯基因列表及GO功能注釋;
(5)在多個樣品間,對與Peak關聯基因做差異分析。
應用領域
由于ChIP-Seq的數據是DNA測序的結果,為研究者提供了進一步深度挖掘生物信息的資源,研究者可以在以下幾方面展開研究:
(1)判斷DNA鍊的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾;
(2)檢測RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點的精确定位;
(3)研究組蛋白共價修飾與基因表達的關系;
(4)CTCF轉錄因子研究。
案例分析
ChIP-Seq案例研究
Ellen Markljung等利用ChIP-Seq技術,發現:家豬IGF2基因(編碼Insulin-like growth factor 2)第三内含子單堿基G→A的替換,導緻抑制因子ZBED6在該基因上結合位點的喪失,從而使IGF2在骨骼肌中上調表達(表達量是正常情況的3倍),這一突變主要影響肌肉生長(提高了骨骼肌的數量,因此豬肉産量提高了3~4%)、心髒增大和脂肪沉積。
ZBED6基因與ZBED6蛋白
ZBED6基因:是失去轉座功能的轉座子,在所有哺乳動物中位于ZC3H11A基因第一内含子中;該基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、馬、家豬中高度保守。Real-time-PCR分析顯示,小鼠Zbed6 mRNA在腦、心髒、腎髒、肝髒、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸組織有不同程度地表達。
ZBED6蛋白是首次報道。ZBED6蛋白含有2個BED結構域和1個hATC二聚結構域;第61~80位和第231~248位氨基酸殘基是2個細胞核定位信号(富Lys-Arg區段,KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI)。該蛋白在哺乳動物中高度保守,尤其是DNA結合BED結構域,在26個物種中(包括家豬)顯示出~100%相似性。
ZBED6蛋白作為抑制因子調控基因表達的方式
用siRNA将小鼠C2C12成肌細胞中的Zbed6基因沉默後的相關實驗結果,證實了ZBED6蛋白作為抑制因子是通過與位于Igf2基因第三内含子中的QTN(Quantitative trait nucleotide)位點結合來抑制Igf2基因的表達。當Zbed6基因沉默後,Igf2基因的表達量升高、細胞增殖(肌管形成)加快、創傷愈合加快。
為了研究ZBED6蛋白作用靶點(Igf2基因及其下遊基因),作者采用ChIP-Seq技術對小鼠C2C12成肌細胞進行分析。AB SOLiD測序得到:
①24million reads(比對到小鼠基因組上),2,499 Peaks;大多數峰(Peaks)集中在Igf2基因内含子中的QTN位點,即,QTN位點是ZBED6蛋白在基因組上的主要結合位點(圖1)。
②GO注釋分析發現,ZBED6蛋白的1200個作用靶點起着發育、轉錄調控、細胞分化等作用(圖2)。其中,262個靶基因編碼轉錄因子,36個含有Homeobox結構域,26個屬于bHLH(basic helix-loop-helix)家族,10個屬于FOX家族,8個細胞核受體,7個屬于SOX家族(圖3)。
綜上所述,IGF2基因突變的家豬和Zbed6基因沉默的小鼠C2C12成肌細胞的表型效應、高度的序列保守、核定位、廣泛的組織分布、許多靶基因有重要的生物學功能,這一系列現象說明:在哺乳動物中,ZBED6是一個重要的轉錄因子,影響着發育、細胞增殖和生長。