方法簡介
在分光光度計中，将不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。如以波長（λ）為橫坐标，吸收強度（A）為縱坐标，就可繪出該物質的吸收光譜曲線。利用該曲線進行物質定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質的方法，稱為紫外分光光度法；用可見光光源測定有色物質的方法，稱為可見光光度法。它們與比色法一樣，都以Lambert-Bee定律為基礎。
上述的紫外光區與可見光區是常用的。但分光光度法的應用光區包括紫外光區，可見光區，紅外光區。波長範圍：
(1)200～400nm的紫外光區；
(2)400～760nm的可見光區；
(3)2.5～25μm(按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>)的紅外光區。
基本原理
選擇吸收
物質與光作用，具有選擇吸收的特性。有色物質的顔色是該物質與光作用産生的。即有色溶液所呈現的顔色是由于溶液中的物質對光的選擇性吸收所緻。由于不同的物質其分子結構不同，對不同波長光的吸收能力也不同，因此具有特征結構的結構集團，存在選擇吸收特性的最大實收波長，形成最大吸收峰，而産生特有的吸收光譜。即使是相同的物質由于其含量不同，對光的吸收程度也不同。利用物質所特有的吸收光譜來鑒别物質的存在（定性分析），或利用物質對一定波長光的吸收程度來測定物質含量（定量分析）的方法，稱為分光光度法。
定量依據
朗伯一比爾（Lambert - Beer）定律是分光光度法定量分析依據的基本原理。當一束單色光（指路由一種顔色的光）通過一均勻的溶液時，一部分被吸收，一部分透過。設入射光的強度為I0，透射光強度為I，則I/I0為透光度，用T表示。百分透過率為 T% = （I/I0）x100%
研究表明：溶液對光的吸收程度即吸光度（A）（又稱消光度E、或光密度D）與透光度（T）呈負對數關系，即：A = - lgT
朗伯定律：有色溶液的吸光程度（A）與其液層厚度（光程）b成正比。當溶液濃度不變時，溶液的液層厚度越大，對光的吸收程度A值越大，則透光度越小。
即：A = ab
比耳定律：有色溶液的吸光程度（A）與其濃度（吸光質點數）C成正比。即當溶液的液層厚度不變時，溶液的濃度越大，對光的吸收程度越大，則透光度越小。
即：A = ac
将以上兩式合并可用下式表示：A = -lgT=abc
即 A = abc。
上式為朗伯比爾定律，其意義為：當一束單色光通過一均勻溶液時，溶液對單色光的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
A =abc 中，吸光系數a，表征吸光物質的 靈敏度。a值越大，靈敏度越高。如果濃度的單位為物質的量濃度（單位為：mol/L），則吸光系數a可以寫成ε ，ε稱為摩爾吸光系數。
由上式可知，當溶液層厚度b和吸光系數a固定時，吸光度A與溶液的濃度成線性關系。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜），從中确定最大吸收波長 ，然後以此波長 的光為光源（單色光），進行吸光度A的測定，這是朗伯比爾定律用于定量分析的首要條件。
檢測儀器
儀器分類
依據光譜區，分光光度計可分為：紫外分光光度計，可見分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計。如果吸光質點是原子，其儀器稱為原子吸收分光光度計。
儀器組成
各種分光光度計的基本組成是：光源系統、分光系統、吸收系統和檢測系統。
儀器精度
為保證測量的精密度和準确度，所有儀器應按照國家計量檢定規程，定期進行校正檢定。
定量方法
利用分光光度法對物質進行定量測定，主要有以下幾種方法：
1、标準管法
将待測溶液與已知濃度的标準溶液在相同條件下分别測定A值，然後按下式求得待測溶液中物質的含量。
CT=（AT/AS）*CS
2、标準曲線法
先配制一系列濃度由小到大的标準溶液，分别測定出它們的A值，以A值為橫坐标，濃度為縱坐标，作标準曲線（A~c工作曲線），可以求出标準曲線的回歸方程。在測定待測溶液時，操作條件應與制作标準曲線時相同，以待測液的A值從标準曲線上查出（得到）該樣品的相應濃度。
3、吸光系數法
當某物質溶液的濃度為1mol/L，厚度為1cm時，溶液對某波長的吸光度稱為該物質的摩爾吸光系數，以ε表示。ε值可通過實驗測得，也可由手冊中查出。例如亞鐵氮二雜菲配合物的ε值 等于11000 L/cm·mol
已知某物質ε值，隻要測出其A值再根據下式便可求得樣品的濃度：c=A/ε。
