概述

分光光度法是在特定波長處或一定波長範圍内光的吸收度，對該物質進行定性或定量分析。常用的波長範圍為：(1)200～380nm的紫外光區，(2)380～780nm的可見光區，(3)2.5～25μm（按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準确度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進行校正檢定。

分光光度計

儀器組成

分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信号處理器和顯示與存儲系統組成。

光譜範圍

包括波長範圍為400~760nm的可見光區和波長範圍為200～400nm的紫外光區。不同的光源都有其特有的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源。

鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400～760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射後,可得到由紅橙，黃綠，藍靛，紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。

氫燈（或氘燈）的發射光譜:氫燈能發出185～400nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源。

物質的吸收光譜：

如果在光源和棱鏡之間放上某種物質的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現了幾條暗線,即光源發射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收後的光譜稱為該溶液的吸收光譜。

不同物質的吸收光譜是不同的.因此根據吸收光譜,可以鑒别溶液中所含的物質。

當光線通過某種物質的溶液時透過的光的強度減弱，因為有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被組成此溶液的物質所吸收隻有一部分光可透過溶液。

入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光。

如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射，分散等因素造成的入射光的損失則：

入射光=吸收光十透過光

分光光度計

原理

分光光度計采用一個可以産生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而産生特定波長的光源，光線透過測試的樣品後，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式：

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

式中:A為吸光度；

I0為入射的單色光強度；

I為透射的單色光強度；

T為物質的透射率；

k為摩爾吸收系數；

L為被分析物質的光程，即比色皿的邊長；

c為物質的濃度；

物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數後可用同樣條件将該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色後再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用标準品或對照品同時操作。

儀器特點

獨特的雙光路、雙光束光學系統，儀器分辨率更高，雜散光更低，穩定性、可靠性更強，分析更加準确；

采用320*240位點陣式高亮6”液晶顯示器，顯示清晰，信息完備；

獨特的長光程光路設計，使儀器分辨率更高，尤其适合微量測試強大的數據處理功能，使測試結果能得到充分的應用，用戶編輯更為簡單快捷；

采用懸架式光學系統設計，整體光路獨立固定在16mm厚的鋁制無變形基座上，底闆的變形和外界的震動對光學系統不産生任何影響，從而大大提高了儀器的穩定性和可靠性；

采用同步正弦機構，波長準确度高，重複性好；

采用ARM系統；

0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0六檔光譜帶寬自動可選，滿足不同用戶的測量需求；

24位高速、高精度A/D轉換，儀器精度更高、反應速度更快；

主要元件采用進口配置，使儀器雜散光更低、穩定性、可靠性更強；

功能更加強大，主機可獨立完成光度測量、定量測量、光譜掃描、動力學、DNA/蛋白質測試，多波長測試及數據打印等功能；

充分考慮不同用戶的使用習慣，本系列儀器都标配元析公司光譜掃描軟件，聯機操作時，除能實現主機的所有測試功能外，還可實現更為強大的數據處理功能，并且使數據存儲達到無限。

儀器指标

型号UV-9000波長範圍190-900nm；光譜帶寬0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0nm六檔可選波長，準确度±0.1nm（D2656.1nm）、±0.3nm；全區域波長重複性≤0.1nm。

光度準确度：±0.2%T

光度重複性：≤0.1%T

雜散光：≤0.01%T

穩定性：±0.0004A/h（500nm處）

基線平直度：±0.001A

噪聲水平：±0.0004A/h

光度範圍：0-200%T

電源：AC220V/50Hz或110V/60Hz

重量：30kg

技術參數：

波長範圍：320∽1000nm

光譜帶寬：4nm

雜散光：≤0.5%（在360nm處）

波長準确度：優于±2nm

透射比準确度：≤±1nmT

常見用途

核酸的定量

核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鍊、雙鍊DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD的吸光值分别相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正确的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾後測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定範圍内變化，即儀器有一定的準确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的準确度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導緻讀數漂移如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在幹擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此範圍内混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一緻；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純淨的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純淨的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他幹擾因子。純樣品，A320一般是0。

蛋白質的直接定量（UV法）

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，将吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性範圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上，隻要觀察A280的吸光值的變化範圍不超過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，隻要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，适合測試較純淨、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的幹擾，如DNA的幹擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質定量

蛋白質通常是多種蛋白質的混合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，産生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。

比色方法

一般有BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。

Lowry法：以最早期的Biuret反應為基礎，并有所改進。蛋白質與Cu2反應，産生藍色的反應物。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate等物質的蛋白不适合此種方法。

BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液裡與Cu2反應産生Cu，後者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系較強，反應後形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的幹擾。

Bradford法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，産生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍；操作更簡單，速度更快；隻需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與一系列幹擾Lowry，BCA反應的還原劑（如DTT，巯基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的标準品會導緻同一樣品的結果差異較大，無可比性。

某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一緻，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的标準樣品不一緻，測試後的濃度也不一緻。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作标準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作标準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的标準蛋白作标準品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導緻測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應後1011分光光度計的重要配件——比色杯的顔色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括标準樣品），都必須在此時間内測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應後的顔色會讓石英或者玻璃着色，導緻樣品吸光值不準确。

細菌細胞密度（OD600）

實驗室确定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準确測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的标準方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之後定量培養後的含菌培養液。為了保證正确操作，必須針對每種微生物和每台儀器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是采用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間後，與培養基反應，發生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀态。

分光光度計的重要配件——比色杯

比色杯按照材質大緻分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃着色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外範圍内測試樣品。

由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。市場已經存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette&reg;塑料比色杯，是比色杯市場上一個革新。随着生命科學以及相關學科發展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計将是分子生物學實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關實驗室的必備設備之一。

随着科技的發展，比色杯已經不是使用分光光度計時的必備物品。國外Nanodrop公司（現已被Thermo Fisher公司收購）生産的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比，已經可以做到無需稀釋樣品，無需使用比色杯，每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。

相關資料

操作方法

1.接通電源，打開儀器開關，掀開樣品室暗箱蓋，預熱10分鐘。

2.将靈敏度開關調至“1”檔（若零點調節器調不到“0”時，需選用較高檔。）

3.根據所需波長轉動波長選擇鈕。

4.将空白液及測定液分别倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室内，使空白管對準光路。

5.在暗箱蓋開啟狀态下調節零點調節器，使讀數盤指針指向t=0處。

6.蓋上暗箱蓋，調節“100”調節器，使空白管的t=100，指針穩定後逐步拉出樣品滑竿，分别讀出測定管的光密度值，并記錄。

7.比色完畢，關上電源，取出比色皿洗淨，樣品室用軟布或軟紙擦淨。

注意事項

1．該儀器應放在幹燥的房間内，使用時放置在堅固平穩的工作台上，室内照明不宜太強。熱天時不能用電扇直接向儀器吹風，防止燈泡燈絲發亮不穩定。

2．使用本儀器前，使用者應該首先了解本儀器的結構和工作原理，以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應該對儀器的安全性能進行檢查，電源接線應牢固，通電也要良好，各個調節旋鈕的起始位置應該正确，然後再按通電源開關。

3．在儀器尚未接通電源時，電表指針必須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進行調節。

日常維護

分析儀器工作者要懂得儀器的日常維護和對主要技術指标的簡易測試方法，自己經常對儀器進行維護和測試，以保證儀器工作在最佳狀态。

一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機械部件的鏽蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降；造成光學部件如光栅、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜鏽蝕，産生光能不足、雜散光、噪聲等，甚至儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護保養時應定期加以校正。應具備四季恒濕的儀器室，配置恒溫設備，特别是地處南方地區的實驗室。

二、環境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機械系統的靈活性、降低各種限位開關、按鍵、光電偶合器的可靠性，也是造成必須學部件鋁膜鏽蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環境和儀器室内衛生條件，防塵。

三、儀器使用一定周期後，内部會積累一定量的塵埃，最好由維修工程師或在工程師指導下定期開啟儀器外罩對内部進行除塵工作，同時将各發熱元件的散熱器重新緊固，對光學盒的密封窗口進行清潔，必要時對光路進行校準，對機械部分進行清潔和必要的潤滑，最後，恢複原狀，再進行一些必要的檢測、調校與記錄。

維護保養

分光光度計作為一種精密儀器，在運行工作過程中由于工作環境，操作方法等種種原因，其技術狀況必然會發生某些變化，可能影響設備的性能，甚至誘發設備故障及事故。因此，分析工作者必須了解分光光度計的基本原理和使用說明，并能及時發現和排除這些隐患，對已産生的故障及時維修才能保證儀器設備的正常運行。

1)若大幅度改變測試波長，需稍等片刻，等燈熱平衡後，重新校正“0”和“100%”點。然後再測量。

2)指針式儀器在未接通電源時，電表的指針必須位于零刻度上。若不是這種情況，需進行機械調零。

3)比色皿使用完畢後，請立即用蒸餾水沖洗幹淨，并用幹淨柔軟的紗布将水迹擦去，以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率。

4)操作人員不應輕易動燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率。

5)1900型等分光光度計，由于其光電接收裝置為光電倍增管，它本身的特點是放大倍數大，因而可以用于檢測微弱光電信号，而不能用來檢測強光。否則容易産生信号漂移，靈敏度下降。針對其上述特點，在維修、使用此類儀器時應注意不讓光電倍增管長時間暴露于光下，因此在預熱時，應打開比色皿蓋或使用擋光杆，避免長時間照射使其性能漂移而導緻工作不穩。

6)放大器靈敏度換擋後，必須重新調零。

7)比色杯的配套性問題。比色杯必須配套使用，否則将使測試結果失去意義。在進行每次測試前均應進行比較。具體方法如下;分别向被測的兩隻杯子裡注入同樣的溶液，把儀器置于某一波長處，石英比色杯;220nm、700nm裝蒸餾水，玻璃比色杯：700nm處裝蒸餾水，将某一個池的透射比值調至100%，測量其他各池的透射比值，記錄其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的範圍内則可以配套使用，若超出此範圍應考慮其對測試結果的影響。

分光光度計分操作中容易出現的幾個典型故障及其排除方法：

1)儀器不能調零。可能原因：

a)光門不能完全關閉。解決方法：修複光門部件，使其完全關閉。

b)透過率“100%”旋到底了。解決方法：重新調整“100%”旋鈕。

c)儀器嚴重受潮。解決方法：可打開光電管暗盒，用電吹風吹上一會兒使其幹燥，并更換幹燥劑。

d)電路故障。解決方法：送修理部門，檢修電路。

2)儀器不能調“100%”。可能原因：

a)光能量不夠。解決方法：增加靈敏度倍率檔位，或更換光源燈(盡管燈還亮)。

b)比色皿架未落位。解決方法：調整比色皿架使其落位。

c)光電轉換部分老化。解決方法：更換部件。

d)電路故障。解決方法：調修電路。

3)測量過程中,“100%”點經常變動。可能原因：

a)比色皿在比色皿架中放置的位置不一緻，或其表面有液滴。解決方法：用擦鏡紙擦幹淨比色皿表面，然後将其安放在比色槽的左邊，上面用定位夾定位。

b)電路故障(電壓、光電接收、放大電路)。解決方法：送修。

4)數顯不穩。可能原因：

a)預熱時間不夠。解決方法：延長預熱時間至30分鐘左右(部分儀器由于老化等原因，長時間處于工作狀态時，也會工作不穩)。

b)光電管内的幹燥劑失效，使微電流放大器受潮。解決方法：烘烤電路，并更換或烘烤幹燥劑。

c)環境振動過大、光源附近空氣流速大、外界強光照射等。解決方法：改善工作環境。

d)光電管、電路等其它原因。解決方法：送修。