應用
根癌農杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染雙子葉植物的受傷組織能引起冠瘦瘤(crown gall).這是一種嚴重危害植物生長的病害(癌症)。已知有90多科600餘種的雙子葉植物能感染這種疾病ru001e0單子葉植物和裸子植物對此病很不敏感,隻少數感染的實例。根癌農杆菌含有一類誘瘤質粒,即Ti質粒(Tumor inducing plasmid),Ti質粒上帶有緻瘤基因。
在誘瘤期間,Ti質粒的一段DNA能整合到植物細胞核中,而使植物細胞發生轉化,成為腫瘤細胞。因此冠廖瘤是一種天然的“遺傳工程系統”,又是研究原核細胞DNA在真核生物中表述的一個模式系統,極受分子遺傳學家的注意,成了植物遺傳操作中深人研究的重要對象。有關冠寥瘤發生的分子生物學概況最近已有詳細綜述E2,3,410人們期望MIV分子遺傳學技術對Ti質粒加以改造,去除對植物有害的緻瘤基因,但仍保留轉化功能,使它成為遺傳工程的載體,将外源基因引人植物細胞,以達到改造植物并創造新植物類型的目的。
TDNA的整合機制
幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農杆菌感染,而産生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤杆菌(A.tumefaciens)。其緻瘤特性是由Ti(tumor-inducing)質粒介導的。
農杆根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮,這些酚類物質可以誘導Vir(Virulenceregion)基因的啟動表達,Vir基因的産物将Ti質粒上的一段T-DNA單鍊切下,而位于根瘤染色體上的操縱子基因産物則與單鍊T-DNA結合,形成複合物,轉化植物根部細胞。T-DNA上有三套基因,其中兩套基因分别控制合成植物生長素與分裂素,促使植物創傷組織無限制地生長與分裂,形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿堿,冠瘿堿有四種類型:章魚堿(octopine)、胭脂堿(nopaline)、農杆堿(agropine)、琥珀堿(succinamopine),使農杆菌生長必需的物質。
結構
在發現根瘤農杆菌誘發冠瘿瘤的本質是Ti質粒後,Ti質粒便成為冠瘿瘤形成基因鑒定與分析的主要研究對象。
Ti質粒大約在160~240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區在36kb左右。除此之外,Ti質粒上還存在Con區(regionencodingconjugation)和Ori區(originofreplication)。
c.Ti質粒約為200kb,重組操作非常苦難,也很難找到單一的酶切位點。
d.Ti質粒不能在大腸杆菌中複制,為了使重組質粒DNA的大量擴增,須添加入大腸杆菌複制子。加入植物細胞的篩選标記,如neor基因,使用植物細胞啟動子及末端polyA化信号,加入多聚人工接頭以利于外源基因的。
植物中一般不存在質粒,為利用農杆菌的Ti質粒,發展了共整合系統和雙元載體系統,避免了在大的Ti質粒上進行分子重組操作的困難。
植物細胞轉化的共整合系統
T-DNA在大腸杆菌質粒上,含有E.coli的選擇标記和植物選擇标記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子,然後将重組質粒轉化到農杆菌中,質粒與Ti質粒上的同源序列發生同源重組,将外源基因整合到Ti質粒上,用于侵染植物細胞。T-DNA重組分子整合到植物細胞染色體DNA上,Kmr篩選轉化細胞。
植物細胞轉化的雙元系統
目前T-DNA轉化植物細胞的标準方法是雙元系統,即穿梭質粒。插入外源基因的重組穿梭質粒直接轉化含有Ti質粒的根瘤農杆菌,經篩選後直接感染植物細胞。與共整合系統所不同的是,含外源基因的質粒可在農杆菌内自主複制并保留下來。農杆菌侵染植物細胞後,植物的創傷信号啟動Ti質粒上的Vir基因,随後将穿梭質粒的T-DNA切割下來,轉移到植物細胞中。
T-DNA上共有三套基因和左右兩個邊界,LB和RB是長為25bp的末端反複重複順序,在切除及整合過程具有重要意義。
tms由兩個成:tms1(iaaM)和tms2(iaaH)
tmr由一個成iptz:
tmt由若幹基因構成,合成稀有氨基酸衍生物,稱為opines。它有三個成員:octopine=精氨酸與丙酮酸的縮合物,Napaline=精氨酸與-酮戊二酸的縮合物,Agropine=谷氨酸與二環糖的縮合物。
據此可将Ti質粒分為三大類,感染的植物誘導合成這些有機堿,但不能利用它們,其分解酶基因在Ti質粒上,分解産物為氨基酸和糖類,供根癌農杆菌使用作為氮源及碳源。
2.T-DNA的整合機制:T-DNA的詳細整合機制尚不清楚,但有幾個環節是明确的:
T-DNA切除由Vir區編碼的特異性内切酶完成,分别在LB和RB的第三個堿基和第四個堿基之間産生缺口,并形成單鍊T-DNA。
T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對稱的,RB順序與整合有關,而LB無關。
T-DNA的整合可以是單拷貝的,也可以是多拷貝的,成串聯形式排列,但整合位點的特異性尚未确定。