苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶

生成反式桂皮酸所需酶
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)催化苯丙氨酸的脱氨反应,使NH3释放出来形成反式肉桂酸。[1]此酶的在植物体内次生物质(如木质素等)代谢中起重要作用。
    中文名:苯丙氨酸解氨酶 外文名: 适用领域: 所属学科: 英文名:phenylalanine ammonialyase 存在部位:高等植物、酵母、菌类可溶性部分 发现时间:1961年在大麦中发现的

简介

是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。EC.4.3.1.5。是1961年J.Koukol,E.Conn在大麦中发现的。存在于高等植物、酵母、菌类的可溶性部分。推测分子量为30万。这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。在很多情况下,其反应成为酚类化合物合成的有步骤的速率阶段。

在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化,用光照,病伤害,植物激素处理等会使活性显著增加。另外有时还受光敏色素所支配。在多数情况下,在组织中活性增加的同时,酶发生失活作用,这时组织中具有活性酶的量很快就会减少,据认为,这种失活是与类蛋白质物质作用有关。此外也已指出有非活性的酶的存在。

活性测定

原理

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)催化苯丙氨酸的脱氨反应,使NH3释放出来形成反式肉桂酸。此酶的在植物体内次生物质(如木质素等)代谢中起重要作用。根据其产物,反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料:马铃薯块茎

(二)仪器设备:1.紫外分光光度计;2.离心机;3.研钵;4.吸滤瓶;5.红光装置;6.打孔器。

(三)试剂:1.0.05mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH8.8);2.0.02mol/L苯丙氨酸(用0.1mol/LpH8.8硼酸缓冲液配制);3.5mmol/L巯基乙醇硼酸缓冲液。

实验步骤

    马铃薯圆片制备

将马铃薯块茎洗净、削皮,用打孔器(直径1.5cm)取圆柱,切除两头近表皮处,中间部分切成2mm厚的圆片。先用自来水漂洗,最后用蒸馏水洗一次,用纱布吸干表面的水。

2.光诱导将圆片平铺在湿润滤纸的培养皿中,置20~30℃红光下处理24h以诱导PAL(也可接种病原菌诱导等)。

3.酶粗提液的制备

经诱导处理的马铃薯圆片5g,加10ml含5mmol/L的巯基乙醇的硼酸缓冲液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或PolyclarAT(除去酚类物质毒害,防止颜色的干扰、少量石英砂在研钵中研磨。匀浆抽气过滤,滤液10,000rpm离心15min,上清液为酶粗提液。上述操作均在0~4℃下进行。

4.活性测定与计算

1ml酶液加1ml0.02mol/L苯丙氨酸,2ml蒸馏水,总体积为4ml。对照不加底物,多加1ml蒸馏水;反应液置恒温水浴30℃中保温,0.5h后用紫外分光光度计在290nm处测定吸光度。以每小时在290nm处吸光度变化0.01所需酶量为一单位(相当每毫升反应混合物形成1μg肉桂酸)。蛋白质含量用Folin-酚法进行测定。

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