载体:生物领域中的载体-中文百科频道

内容简介

基因工程的一个重要环节是基因工程载体( vector)的设计和应用。基因克隆过程中往往需要借助特殊的工具才能使外源DNA分子进入宿主细胞中并进行复制和表达。这种携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称为载体。

一般来说，理想的基因工程载体须具备以下功能：

①具有复制起始位点，能使插入的外源目的基因或DNA片段在宿主细胞内进行独立并且稳定的自我复制；

②在DNA复制的非必需区具有多种限制酶的单一识别位点，能被各种限制酶所识别并插入外源DNA片段；

③具有用来筛选重组体DNA的选择标记基因；

④序列较短，利于容纳较长的外源DNA片段；

⑤具有较高的遗传稳定性。为了满足以上要求，通常选择生物体天然存在的质粒和噬菌体或病毒DNA作为载体母本，对其进行必要的修饰和改造，构建出具有多种作用的载体DNA分子。

载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。穿梭载体含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的细胞中复制，如既能在原核生物中复制也能在真核生物中复制的载体，不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列( ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。

必备条件

①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。

②有多个限制酶（Restriction enzymes）切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。

③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。

④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。当前所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。

⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。

基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体。

载体分类

质粒载体

质粒载体是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。

噬菌体载体

利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。

病毒载体

质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。

当前人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA也有可能成为运载体。

功能

绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双链分子，其功能包括以下几方面。

(1)为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。从理论上讲，任何DNA分子均可以物理渗透的方式进入生物细胞中，但这种频率极低，以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼接所形成的DNA重组分子转入受体细胞的概率比外源DNA片段单独转化要高几个数量级。

(2)为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。外源基因进入受体细胞后面临两种选择，或者直接整合在受体细胞染色体DNA的某个区域内，作为其一部分复制并遗传，或者独立于受体细胞染色体DNA而存在，在后一种情况下，载体DNA分子必须为外源基因提供独立的复制功能，否则外源基因不可能在受体细胞中复制和遗传。

(3)为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。外源基因的扩增依赖于载体分子在受体细胞中高拷贝自主复制的能力，这种能力通常由载体DNA上的若干相关基因编码。同时，外源基因高效表达所需的调控元件一般也由载体分子提供。

应当指出的是，上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备，DNA重组克隆的目的不同，对载体分子的性能要求也不同。但对于所有不同用途的载体而言，为外源基因提供复制或整合能力是必不可少的，因此通常选择生物体内天然存在的质粒以及噬菌体或病毒DNA作为载体蓝本，并根据分子克隆的操作原理，对之进行必要的修饰和改造，构建出具有多种性能的载体DNA分子。