内皮抑素

結構特點

内皮抑素是1997年O’Reilly等從培養的小鼠内皮細胞瘤(EOMA)上清中分離純化的一種内源性血管生成抑制劑,為20kd分子量蛋白質。内皮抑素是膠原18的降解産物,降解過程至少包括兩步酶解,參與酶解的可能有彈性蛋白酶、組織蛋白酶L和基質金屬蛋白酶。

進一步晶體結構分析發現:内皮抑素結構表面有一由11個精氨酸殘基組成的堿性區域,為肝素結合位點,這解釋了内皮抑素對肝素的高親和力特性,也可能是通過該區域與血管生成因子競争結合肝素,起到抑制血管生成作用。但也有研究表明内皮抑素與血管壁的結合不依賴于肝素結合位點,且與FGF-2無競争性抑制作用。

此外,在内皮抑素序列中發現由其N端第1,3,11位3個組氨酸及第76位的天冬氨酸殘基組成的鋅離子結合位點,鋅與内皮抑素的N端環繞形成一個二聚體結構。最初認為内皮抑素與鋅離子結合對其抗血管生成活性很重要,但後來通過基因修飾方法去除鋅離子結合位點的研究表明,内皮抑素抑制内皮細胞的遷移及腫瘤的生長并不依賴鋅離子結合位點。

生物學功能

内皮抑素對血管内皮細胞的抑制作用内皮抑素能特異性抑制血管内皮細胞在bFGF誘導下的增殖,抑制内皮細胞的遷移,誘導内皮細胞凋亡,但對非内皮細胞,如平滑肌細胞、3T3成纖維細胞、Lewis肺癌細胞等均無抑制作用。Kim等研究也證明,内皮抑素能抑制人臍靜脈内皮細胞穿透人工基底膜的能力,且與抑制效果呈劑量依賴關系。

内皮抑素對血管生成的抑制作用目前,多種實驗都能證實内皮抑素對生長的血管産生抑制作用,而對靜止的血管組織不起作用。O’Reilly等通過雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗,用大腸杆菌或杆狀病毒表達的内皮抑素均顯示出對雞胚血管生成有明顯抑制作用,且未見毒性反應。

Bloch等研究證明内皮抑素并不影響小鼠傷口愈合、傷口收縮、傷口感染及傷口上皮再生,但能減少肉芽組織的形成。Yin等将攜帶内皮抑素基因的重組慢病毒注入由TNF誘導的小鼠初期類風濕性關節炎的關節内,結果顯示内皮抑素可抑制關

節内血管生成及血管翳的形成,減緩類風濕性關節炎的進展。說明内皮抑素不僅可以抑制腫瘤血管新生,對病理性血管性炎症也有抑制作用。

内皮抑素對腫瘤生長和轉移的抑制作用國内外許多學者利用重組内皮抑素蛋白或通過内皮抑素基因治療實驗表明,内皮抑素對多種實體瘤的生長和轉移都能産生抑制作用。

Bohen用鼠重組内皮抑素幾乎完全抑制小鼠Lewis肺癌、黑素瘤、纖維素瘤、血管内皮瘤、腎細胞癌等原發竈腫瘤的生長,治療6周期後腫瘤進入休眠期,停藥後腫瘤無複發,且未見轉移竈發生,不産生耐藥性。同時在細胞水平,也有實驗證明内皮抑素能抑制腫瘤細胞在人工基底膜凝膠中的遷移。Perletti等利用二甲基苯并蒽(DMBA)誘發的大鼠乳腺癌動物模型,連續4周每天皮下注射内皮抑素20mg/ kg ,使腫瘤停藥後4周仍處于休眠狀态,表明内皮抑素對原發腫瘤也有明顯抑制作用。

内皮抑素的作用機制

目前,内皮抑素抗血管生成治療已經取得驚人的效果,但其作用機制尚未完全闡明,

其可能的作用機制主要有:

①通過下調β-連環素(β-catenin)的轉錄活性,抑制周期蛋白D1的表達,引起内皮細胞G1期阻滞;

②下調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達,誘導内皮細胞凋亡;

③與基質金屬蛋白酶2前體蛋白(pro-MMP2)結合形成穩定複合體,阻止proMMP2的激活,并抑制MMP2和MMP1的催化活性,從而抑制内皮細胞的遷移;

④與原肌球蛋白結合,破壞微絲結構的完整性,使細胞運動功能喪失,誘導凋亡;

⑤抑制c-myc表達而抑制内皮細胞遷移;

⑥通過肝素結合位點與内皮細胞表面的接頭蛋白Shb受體的SH2區域結合,激活酪氨酸激酶信号轉導系統,導緻内皮細胞G1期阻滞,誘導内皮細胞凋亡;

⑦整合素α5β1在調節bFGF誘導的血管生成中起重要作用,内皮抑素可以和整合素α5β1直接結合,影響内皮細胞同細胞外基質的黏附,抑制内皮細胞的遷移和生長;

⑧抑制VEGF受體KDR/Flk-1酪氨酸磷酸化,從而抑制VEGF與内皮細胞的結合,抑制VEGF誘導的細胞外信号調節激酶ERK活性。

内皮抑素抗腫瘤血管生成治療的研究

直接使用重組内皮抑素蛋白

目前重組内皮抑素基因工程表達系統主要有大腸杆菌表達系統、酵母表達系統、哺乳動物細胞表達系統等。大腸杆菌表達系統表達量高,但産物多以包涵體形式存在,不可溶解,難以複性,造成應用不便,雖然經過蛋白重新折疊可溶,但此過程會損失大量蛋白。哺乳動物細胞的表達産物活性高,但是表達量低,難以純化。

而用酵母表達産量高,易于純化,活性高,特别是畢赤酵母表達系統被廣泛地應用于内皮抑素的表達,目前美國用于I期臨床試驗的内皮抑素就是畢赤酵母的表達産物。O’Reilly等利用大腸杆菌表達的内皮抑素注入荷瘤小鼠體内,2. 5 mg/ kg使Lewis肺癌移植瘤體積縮小53 % ,10mg/kg則瘤體體積縮小97% ,增至20mg/kg,原發瘤幾乎完全萎縮,而0. 3 mg/ (kg·d)的内皮抑素就能完全抑制Lewis肺癌轉移竈的生長。

通過載體轉導内皮抑素基因

通過适當載體轉導内皮抑素基因,使其在體内長期、穩定表達生物活性高的内皮抑素,有效地彌補了蛋白治療的不足。已證實質粒、脂質體、腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒及慢病毒等都是有效的載體。相對非病毒載體,應用病毒載體轉染後可獲得更高的内皮抑素血漿濃度。Feld2man等将表達内皮抑素的腺病毒重組體經尾靜脈注入MC38腺癌小鼠體内,小鼠血漿内皮抑素濃度高達1770ng/ml,使相對不易感染腺病毒的MC38腺癌抑制率仍達40%。

其他治療方法

Joki等将内皮抑素基因轉導到某些細胞内,再将這種可分泌内皮抑素的細胞用藻酸鹽包裹成微膠囊,注入大腦内後細胞可抵禦機體排斥和組織中酶的消化,持續分泌一定有效濃度的内皮抑素,并有效地抑制了神經膠質瘤的生長。同樣,通過微量泵持續給藥的方法也能使體内内皮抑素的濃度保持穩定,抑瘤效果明顯強于間斷給藥。

國内學者徐根興等利用青春雙歧杆菌作載體,将内皮抑素基因導入雙歧杆菌後注入腫瘤小鼠尾靜脈内,檢驗發現隻在實體瘤中存在青春雙歧杆菌,而其他正常組織未見青春雙歧杆菌,同時也高效地抑制了腫瘤的生長和血管新生。而且他們還用轉人内皮抑素基因雙歧杆菌制成口服制劑,經多例晚期實體腫瘤志願者臨床試驗證明,其對肝癌、胃癌、腸癌、肺癌等實體腫瘤的治療有較好的抑瘤效果。

問題與展望

内皮抑素從發現到進入目前Ⅱ期臨床試驗,短短數年時間,取得的進展令世人倍受鼓舞。實驗表明内皮抑素特異性抑制血管内皮細胞作用肯定,對多種依賴血管生成的實體瘤都有抑制作用,且無耐藥性和明顯毒副作用,為腫瘤的臨床治療開辟了一條新路。随着内皮抑素作用機制的完全闡明,及如何大規模的生産、純化高效有活性的重組内皮抑素蛋白,如何延長内皮抑素在體内的半衰期,如何選擇安全高效的合适載體來進行基因治療,如何正确地選擇适應症和治療對象等這一系列問題的解決,相信内皮抑素對腫瘤的抗血管生成治療将有更大的應用前景。