操作要求
層流手術室的空氣壓力根據其不同區域（如手術間、無菌準備間、刷手間、麻醉間和周圍幹淨區域等）潔淨度不同要求而不同。不同級别的層流手術室其空氣潔淨度标準不同，例如美國聯邦标準1000級為每立方尺空氣中≥0.5μm的塵粒數，≤1000顆或每升空氣中≤35顆。10000級層流手術室的标準為每立方尺空氣中≥0.5μm的塵粒數≤10000顆或每升空氣中≤350顆。依次類推。
具體操作
嚴格淨化各手術室空氣淨化系統在手術室牆面四角、淨化機組、天花闆、走廊、新風機、排風機都設有不同級别的過濾器，并對其進行定期清潔、維修和更換，嚴格保證室内空氣的無菌；另外，層流手術室的衛生管理工作除了日常清潔工作和過去一樣，不能有絲毫放松，還對室内的清潔工作有特殊的要求，室内牆角全部為弧形結構設計，找不到任何一個90°的牆角，使細菌無處藏身，避免了清除不盡的死角，并且室内無須使用物理或化學方法進行消毒，這樣既節省勞動又防止外來污染的進入。
正壓通氣
層流手術室不僅要求高度潔淨的空氣（進入手術室的空氣首先須經高效過濾器淨化），而且要求能控制氣流的流通方向（即采用層流超淨裝置），手術室内形成正壓環境，使氣流從潔淨度高的手術區域流向潔淨度低的區域，一股細小、薄層的氣流，以均勻的流速向同一方向輸送，并帶走和排出氣流中的塵埃顆粒（塵粒）和細菌。
目前，層流手術室分為垂直層流式和水平層流式兩種。垂直層流式高效過濾器裝在手術病床的正上方，氣流垂直吹送，回風口設在牆面的四角，确保手術台潔淨度達标，一般多采用垂直層流式效果較好。正是采用的這種垂直的層流式，在手術室内的頂部還設置了一個吊塔式的負壓吸引系統，将醫生在手術時呼出的空氣吸出塔外，進一步保證手術室的潔淨和無菌，降低手術的感染率。
單通道流向
醫院在層流手術室與消毒櫃之間制作了一堵牆，并設立進、出單通道，需消毒的物品經過“輸出”通道直接從手術室轉移到消毒櫃，消毒後經過“輸入”通道轉移到手術室，這樣避免了消毒物品在轉移的過程中二次污染。
流程管理
層流潔淨手術室的工作流程管理具體如下：
1.1嚴格着裝管理：進入手術室人員務必按規定穿高壓滅菌的手術衣，戴一次性無菌口罩、帽子，離開時衣褲、鞋、帽、口罩放在指定位置，患者均穿清潔的病員服，用交換車接送，戴隔離帽。
1.2空氣淨化系統的開關及清潔：每日早晨由夜班護士提前1h開啟手術間空調系統，并将溫度按需調至22℃～25℃，濕度控制在40%～60%。每日手術結束後，有清潔工用标志明确、分區使用的衛生潔具将手術間打掃幹淨，關閉電動門，經1h層流後關閉空調系統。急診手術間不關閉空調系統。連台手術在前一台手術完成後立即進行室内濕式清潔，并關閉30min後進行下一台手術。
1.3手術床的放置：手術床放于手術間淨化區域的中心。頭面部手術時将手術床向病人腳部适當移動，下肢手術時将手術床略向頭部移動，以保證手術區域和器械台完全處于淨化區内。
1.4保持手術間的正壓：手術中保持電動門處于關閉狀态，盡量減少開關次數，嚴禁開門手術。因為手術室的環境是一個密閉的潔淨環境，門關閉時室内的氣壓大于室外的氣壓，從而保證手術室内的潔淨空氣隻能向室外流動，室外的空氣不會進入室内，開門後就破壞了壓差系統，手術間的淨化質量也将受到影響。
1.5污物處理流程：手術完畢後，污染敷料和器械由洗手護士從傳遞窗向外走廊傳送，迅速關閉傳遞窗内門，取出物品後立即關閉傳遞窗外門。外走廊有清潔工及時處理，污染物紮緊袋子後運送指定處存放。
層流潔淨手術室的維護
2.1專人維護，定期監測：整個空調系統應有專人負責，定期檢查、維修、保養，對過濾網及時清洗。每個月對手術室空氣、手術室人員的手及手術室無菌物品表面采樣進行細菌培養，檢查淨化效果，發現不合格及時找出原因，并采取有效措施。
2.2回風口及地面的清潔維護：每日早晨用濕布抹擦所有物體表面及回風口，每周徹底清洗回風口、天花闆的回風紗窗。地面每日用專用的清潔劑拖擦，再用清水拖淨，如有血迹及其它污染物污染時，應及時用消毒劑擦洗。搬運重物時應在地面上墊其它物品，以免在地面上劃痕。
2.3中央控制面闆的維護：中央控制面闆包括時鐘、計時鐘、溫濕度控制器、照明、空調機組、對講系統等。護士操作時要掌握要領，正确操作，輕輕觸摸開關即可，毋須用力敲打。
2.4電動門的維護：電動門開關方式包括電動、感應、手動三種。電動開關隻需用手或肘部輕輕按壓即可，切忌重壓或長時間按壓。使用感應時隻需膝部或腳接近感應窗口，門便自動開啟。如果出現故障時需關閉電源，利用手動，切忌強行拖拉。工作人員合理安排工作程序，避免增加不必要的開門次數。
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