拓撲異構酶:切斷DNA的一條或兩條鍊中的磷酸二酯鍵-中文百科頻道

簡介

DNA拓撲異構酶是存在于細胞核内的一類酶，他們能夠催化DNA鍊的斷裂和結合，從而控制DNA的拓撲狀态，拓撲異構酶參與了超螺旋結構模闆的調節。哺乳動物中主要存在兩種拓撲異構酶。DNA拓撲異構酶I通過形成短暫的單鍊裂解-結合循環，催化DNA複制的拓撲異構狀态的變化；相反，拓撲異構酶II通過引起瞬間雙鍊酶橋的斷裂，然後打通和再封閉，以改變DNA的拓撲狀态。哺乳動物拓撲異構酶II又可以分為αII型和βII型。拓撲異構酶毒素類藥物的抗腫瘤活性與其對酶-DNA可分裂複合物的穩定性相關。這類藥物通過穩定酶-DNA可分裂複合物，有效地将酶轉換成纖維毒素。

臨床使用

這些藥物包括阿黴素（adriamycin）、放線黴素D（actinomycinD）、道諾梅素（daunomycin）、VP-16、VM-26（替尼泊苷teniposide或者表鬼臼毒素（epipodophyllotoxin）。相對來說，無論是臨床，還是處在試驗階段的，作為哺乳動物異構酶II型毒素的藥物較多

雙-和四苯咪唑（Chen等，CancerRes.1993,53,1332-1335;Sun等,J.Med.Chem.1995,38,3638-3644；Kim等,J.Med.Chem.1996,39,992-998），某些白屈菜生物堿（benzo[c]phenanthridine）和原小檗堿類生物堿（protoberberine）與合成的類似體（Makhey等，Med.Chem.Res.1995,5,1-12；Janin等，J.Med.Chem.1975，18，708-713；Makhey等，Bioorg.&Med.Chem.1996,4,781-791），以及bulgerain（Fujii等,J.Biol.Chem.1993，268，），saintopin（Yamashita等，Biochemistry1991，30，5838-5845）和indolocarbazoles(Yamashita等，Biochemistry1992，31，12069-12075)。

其他被确定的拓撲異構酶毒素則包括某些白屈菜生物堿（benzophenanthridine）和cinnoline化合物（見LaVoie等，美國專利6140328，以及WO01/32631）。盡管這些化合物大有用途，但是由于其較低的溶解性使得他們的應用受到限制。

2006年1月下旬，美國專利局連續授予了美國新澤西大學關于以拓撲異構酶（topoisomerase）為作用靶位的氨基和硝基替代類藥物的合成及應用的四個專利。

分類

可分為兩類一類叫拓撲異構酶I，一類叫拓撲異構酶II。拓撲異構酶I催化DNA鍊的斷裂和重新連接，每次隻作用于一條鍊，即催化瞬時的單鍊的斷裂和連接，它們不需要能量輔因子如ATP或NAD。E.coliDNA拓撲異構酶I又稱ω蛋白，大白鼠肝DNA拓撲異構酶I又稱切刻-封閉酶(nicking-closingenzyme)。拓撲異構酶II能同時斷裂并連接雙股DNA鍊．它們通常需要能量輔因子ATP。在拓撲異構酶II中又可以分為兩個亞類：一個亞類是DNA旋轉酶(DNAgyrase)，其主要功能為引入負超螺旋，在DNA複制中起十分重要的作用。迄今為止，隻有在原核生物中才發現DNA旋轉酶．另一個亞類是轉變超螺旋DNA(包括正超螺旋和負超螺旋)成為沒有超螺旋的松弛形式(relaxedform)。這一反應雖然是熱力學上有利的方向，但不知道為什麼它們仍然像DNA旋轉酶一樣需要ATP，這可能與恢複酶的構象有關。這一類酶在原核生物和真核生物中都有發現。

第一類

DNA拓撲異構酶能催化的反應很多，這裡隻能作簡單叙述。DNA拓撲異構酶I對單鍊DNA的親和力要比雙鍊高得多，這正是它識别負超螺旋DNA的分子基礎，因為負超螺旋DNA常常會有一定程度的單鍊區。負超螺旋越高，DNA拓撲異構酶I作用越快。現已知道，生物體内負超螺旋穩定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物體通過拓撲異構酶1和II的相反作用而使負超螺旋達到一個穩定狀态。現已發現，編碼E．coli拓撲異構酶I的基因topA發生突變，則會引起旋轉酶基因的代償性突變；否則，負超螺旋增高，細胞生活能力降低。拓撲異構酶I作用的堿基序列特異性不高，但切點一定在C的下遊方向4個堿基(包括C本身)的位置。在将DNA單鍊切斷後，拓撲異構酶I連接于切口的5端，并貯藏了水解磷酸二脂鍵的能量用以連接切口，因而拓撲異構酶I的作用不需能量供應。此外．拓撲異構酶I還能促進兩個單鍊環的複性，其作用是解除複性過程所産生的鍊環數的負值壓力，以使複性過程進行到底。如果在一個單鍊環上一個部位切斷，而使另一部位繞過切口．則可産生三葉結結構分子(trefoilknot)。如果有兩個雙鍊環，其中一個有一個切刻，拓撲異構酶1則可以将切刻對面的一條鍊切斷，伎完整的雙鍊環套進去，再連接起來而成為環連體分子(catenane)，以上這三種反應示于右圖。拓撲異構酶I還能催化其他反應，這将在複制和重組的機制中再講述。

第二類

大腸杆菌的拓撲異構酶II(gyrase)除了引入負超螺旋以外．還具有形成或拆開雙鍊DNA環連體和成結分子的能力。II類拓撲異構酶沒有堿基序列特異性，它們可以和任何相交的兩對雙鍊DNA結合。DNA旋轉酶有兩個α亞基和兩個β亞基。α亞基約105KDa，為gyrA基因所編碼，具有磷酸二脂酶活性，可為萘啶酮酸(nalidixicacid)所抑制。A亞基約95KD，為graB基因所編碼，具有ATP酶活性，可為新生黴素(novobiocin)所抑制。這兩種藥物均可抑制野生型大腸杆菌的DNA複制。可見DNA旋轉酶為E．coli的複制所不可缺少的。在切斷一條DNA雙鍊後，兩個a亞基各結合于切口的一個5'端，并貯藏了水解磷酸二酯鍵而獲得的能量，由于該酶的整體性，因而DNA鍊的四個斷頭并無任意旋轉的可能性。由于酶的别構效應，使完整的雙鍊穿過切口，然後再重新形成磷酸二酯鍵。β亞基的功能在于水解ATP以使酶分子恢複原來的構象，以便進行下一輪反應。這一點可以用ATP的同系物β,γ-亞氨基ATP代替ATP而得到證實。因為這一同系物不能被DNA旋轉酶所水解，但它确能促進第一輪拓撲異構反應，使負超螺旋增加，而妨礙以後進一步的拓撲異構反應。

化學反應

DNA拓撲異構酶催化反應

很多，其反應本質是先切斷DNA的磷酸二脂鍵，改變DNA的鍊環數之後再連接之，兼具DNA内切酶和DNA連接酶的功能．然而它們并不能連接事先已經存在的斷裂DNA，也就是說，其斷裂反應與連接反應是相互耦聯的。拓撲異構酶（包括Ⅰ型和II型）都可以用符号轉化模型進行解釋（下圖左中）

除了DNA拓撲異構酶可以産生異構變化以外，很多能夠嵌入相鄰堿基之間影響堿基堆集作用的試劑，特别是片狀的染料分子．也能改變DNA的拓撲狀态，最明顯的例子就是溴化乙錠(ethidiumbromide)。例如以SV40的CCC分子與溴化乙錠的結合試驗為例，當沒有染料時，此DNA為負超螺旋，具有較高的沉降常數(21S)；當加入染料分子與核苷酸之比為0.05時，沉降數降至l6S，此時DNA為沒有超螺旋的松弛形式；當染料分子和核苷酸的比值增加到0.09時，沉降常數又上升到大約21S，此時DNA分子為正超螺旋。這種關系如上圖右所示，不過要注意的是，溴化乙錠并沒有改變Lk值，隻不過是由溴化乙錠分子的嵌入，增加了局部DNA二級結構的緊纏狀态。因而，随着嵌入染料分子數的增多，起初表現為負超螺旋的減少與消失，随後便是正超螺旋的增加。這與單鍊DNA結合蛋白促進負超螺旋轉變為泡狀結構的情況是類似的。

拓撲異構酶（topoisomerase）:通過切斷DNA的一條或兩條鍊中的磷酸二酯鍵，然後重新纏繞和封口來改變DNA連環數的酶。DNA促旋酶。

DNA拓撲異構酶DNAtopoisomerase

為催化DNA拓撲學異構體相互轉變的酶之總稱。催化DNA鍊斷開和結合的偶聯反應，為了分析體外反應機制，用環狀DNA為底物。在閉環狀雙鍊DNA的拓撲學轉變中，要暫時的将DNA的一個鍊或兩個鍊切斷，根據異構體化的方式而分為二個型。切斷一個鍊而改變拓撲結構的稱為Ⅰ型拓撲異構酶（top-oisomeraseⅠ），通過切斷二個鍊來進行的稱為Ⅱ型拓撲異構酶（topoisomeraseⅡ）。屬于Ⅰ型的拓撲異構酶，有大腸杆菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11萬的單個多肽鍊所成）及各種真核細胞中存在的切斷-結合酶（nicking-closingenzyme，分子量約6萬5千—7萬的及分子量約10萬的）。Ⅱ型拓撲異構酶，有存在于細菌中的DNA促旋酶、噬菌體T4的拓撲異構酶Ⅱ以及真核細胞中依賴ATP的拓撲異構酶Ⅱ等。另外，噬菌體λ的irt基因産物和噬菌體φX174的基因A的産物等也具有切斷—結合酶的活性，可認為是拓撲異構酶之一種。Ⅰ型拓撲異構酶不需要ATP的能量而催化異構體化，作為反應的中間産物，在原核生物來說是遊離型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端與酶形成共價鍵，而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端與酶形成共價鍵。此酯鍵中所貯存的能量，可能在切斷端的再結合上起着作用。Ⅰ型拓撲異構化酶催化的反應有下列各種：使超螺旋DNA在每一切斷—結合反應中，使L數（參見DNA拓撲學異構體）發生一種變化，即松弛（relaxation）。将互補的單鍊環狀DNA轉變成具有螺旋結構的雙鍊環狀DNA，使單鍊DNA打結（topologicalknot）或解結。另外在二個環狀雙鍊DNA一個分子的一個鍊切斷時，形成鍊環狀二聚體的分子（ca-tenane）。在Ⅱ型拓撲異構酶中，DNA促旋酶可單獨催化閉環狀DNA産生超螺旋，這是獨特的。其它二個型的酶，除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外，還可催化促旋酶的催化反應。真核細胞的拓撲異構酶Ⅰ，參與核小體的形成，細菌的ω蛋白參與轉錄和某種轉位子的插入。促旋酶和T4拓撲異構酶Ⅱ參與DNA的複制和轉錄過程。DNA 拓撲異構酶 I （DNATopoisomeraseI）催化4種反應：

①超螺旋的松弛；

②繩結(knot)的形成；

③環狀雙鍊分子的形成；

④環狀雙鍊分子的連接。本酶由于來源于小牛胸腺，與來源于原核生物的酶性質不同，即使在Mg2+不存在的條件下也顯示活性。而且，原核生物由來的DNATopoisomerase I 隻作用負鍊的超螺旋分子，而本酶則能使正負兩方的超螺旋分子均形成松散型。

新發現

DNA螺旋與拓撲異構酶相互作用的新發現

一個荷蘭人領導的國際性研究組在分子水平上破解了自然釋放DNA中積累起來的扭曲張力的機制。來自Delft理工大學、EcoleNormaleSuperieure和Sloan-Kettering研究所的研究人員将他們的發現公布在3月31日的《自然》雜志上，并成為這一期雜志的封面。

IB型拓撲異構酶能夠釋放DNA鍊中積累的扭力。研究過程中，研究人員能夠在分子水平上跟蹤一個單個的拓撲異構酶分子一段時間内在單個DNA分子上的活動。拓撲異構酶能夠夾着DNA、切開兩個DNA鍊中的一個并使DNA在與粘性末端重新結合在一起前變得舒展。在靈敏的檢測儀器的幫助下，研究人員能夠測量不同參數，如在酶空腔中的旋轉的DNA的摩擦力。這項研究對DNA和這種酶之間的相互作用有了新的了解。

DNA的兩個單鍊紐在一起并形成雙螺旋結構，而雙鍊的堿基對序列儲存着遺傳信息。在細胞分裂過程中，遺傳物質被複制并且負責複制的酶必須能夠将這些堿基序列轉錄。但是要實現這個過程就必須将需要轉錄的DNA部分變直。這種纏繞和舒展共存的DNA分子中産生了扭力，其扭力的大小随着細胞分裂過程的發展而增加。這種力能夠延遲細胞分裂過程并且在一些情況下甚至終止分裂，而IB型拓撲異構酶則能減少這些扭力。

這種酶釋放DNA扭力的步驟如下：拓撲異構酶先像夾子一樣夾住雙鍊DNA，然後瞬時穿過兩條DNA鍊中的其中一條。DNA分子中積累的這種扭力然後在完整鍊附近被消磨掉。在旋轉之後，這種酶再次緊緊抓住旋轉的DNA并将斷裂的鍊重新粘連起來。研究人員能夠測定出這種拓撲異構酶在剪切和粘連過程之間卸掉的超螺旋的确切數目。

IB型拓撲異構酶工作的精确機制還對癌症研究有重要意義。能夠抑制IB拓撲異構酶功能的藥物已在臨床上有所使用，但它們的使用可能在獲得這些發現後得到改善