高效液相色譜:色譜法的重要分支-中文百科頻道

簡介

高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是指流動相為液體的技術。早期的液相色譜（經典液相色譜）是将小體積的試液注入色譜柱上部，然後用洗脫液（流動相）洗脫。這種經典色譜法，流動相依靠自身的重力穿過色譜柱，柱效差(固定相顆粒不能太小)，分離時間很長。

70年代初期發展起來的高效液相色譜法，克服了經典液相色譜法柱效低，分離時間很長的缺點。成為一種高效、快速的分離技術。高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔闆數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。

高壓泵将貯液罐的流動相經進樣器送入色譜柱中，然後從檢測器的出口流出，這時整個系統就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時，流經進樣器的流動相将其帶入色譜柱中進行分離，分離後不同組分依先後順序進入檢測器，記錄儀将進入檢測器的信号記錄下來，得到液相色譜圖。

發展曆史

1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、裡普斯克等人開發了世界上第一台高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔闆數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘内完成。

1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實踐》一書，标志着高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此後的時間裡，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發展。

1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨着困境，後來的研究人員便采用微粒固定相來突破着一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實現了高速傳質，為高效液相色譜技術的發展奠定了穩固的基礎。随着填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實現。1960年代研制出氣動放大泵、注射泵及低流量往複式柱塞泵，但後者的脈沖信号很大，難以滿足高效液相色譜的要求。

1970年代，往複式雙柱塞恒流泵，解決了這一問題。1970年代後科克蘭制備出全多孔球形矽膠，平均粒徑隻有7μm，具有極好的柱效，并逐漸取代了無定形微粒矽膠。之後又制造出的鍵合固定相使柱的穩定性大為提高，多次使用成為可能。1970年後，适合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年後，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們越來越認識到改變流動相的組成事提高選擇性的關鍵。

特點

1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。

2.高速：流動相在柱内的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少于1h。

3.高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。

4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。

5.适應範圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，隻要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大于400以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總數的75%～80%）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。

主要類型

1、吸附色譜（AdsorptionChromatography）

2、分配色譜（PartitionChromatography）

3、離子色譜（IonChromatography）

4、體積排阻色譜（SizeExclusionChromatography）

5、親和色譜（AffinityChromatography）

分離原理

根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：

1．液—液分配色譜法(Liquid-liquidPartitionChromatography)及化學鍵合相色譜(ChemicallyBondedPhaseChromatography)流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從于下式：式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度；Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。

a.正相液—液分配色譜法(NormalPhaseliquidChromatography):流動相的極性小于固定液的極性。

b.反相液—液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動相的極性大于固定液的極性。

c.液—液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。

2．液—固色譜法。流動相為液體，固定相為吸附劑（如矽膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子(X)和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競争吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：XmnSa======XanSm式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。

當吸附競争反應達平衡時：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K為吸附平衡常數。[讨論：K越大，保留值越大。]

3．離子交換色譜法(Ion-exchangeChromatography)。IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而将它們分離。

以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：X-(溶劑中)(樹脂-R4NCl-)===(樹脂-R4NX-)Cl-(溶劑中)

當交換達平衡時：KX=[-R4NX-][Cl-]/[-R4NCl-][X-]

分配系數為：DX=[-R4NX-]/[X-]=KX[-R4NCl-]/[Cl-]

凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。

4．離子對色譜法(IonPairChromatography)。離子對色譜法是将一種(或多種)與溶質分子電荷相反的離子(稱為對離子或反離子)加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：X水相Y-水相===XY-有機相式中：X水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基铵、氫氧化十六烷基三甲铵等）；XY---形成的離子對化合物。

當達平衡時：KXY=[XY-]有機相/[X]水相[Y-]水相

根據定義，分配系數為：DX=[XY-]有機相/[X]水相=KXY[Y-]水相

離子對色譜法(特别是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特别是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。

5．離子色譜法(IonChromatography)。用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的幹擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-随流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：

抑制柱上發生的反應：R-HNaOH-===R-NaH2O；R-HNaBr-===R-NaHBr-

可見，通過抑制柱将洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸HBr-，可用電導法靈敏的檢測。

離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽離子分析。

6．空間排阻色譜法(StericExclusionChromatography)。空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離隻與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，随流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。