瓊脂糖凝膠電泳:用瓊脂糖凝膠作支持物的電泳法-中文百科頻道

原理

瓊脂糖凝膠電泳的原理概述瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鍊狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鍊依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。因此該凝膠适合于免疫複合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的檢測。

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區别是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在湧動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于淨電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用于核酸的研究中。

蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個原理可将其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05為最适。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離範圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的範圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達10^7bp的DNA片段。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重複性質，相同數量的雙鍊DNA幾乎具有等量的淨電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

操作流程

準備幹淨的配膠闆和電泳槽，注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信号弱、模糊甚至缺失的現象。

選擇電泳方法

一般的核酸檢測隻需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特别是隻有幾個bp的差别應該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合适的巨大DNA鍊應該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鍊用普通電泳可能跑不出膠孔導緻缺帶。

正确選擇凝膠濃度

對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現象。

适合的電泳緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用後，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳産生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。

電泳的合适電壓和溫度

電泳時電壓不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30℃，對于巨大的DNA電泳，溫度應該低于15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導緻出現條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。特别是電壓太大可能導緻小片段跑出膠而出現缺帶現象

DNA樣品的純度和狀态

注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以産生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙醇沉澱可以去除多餘的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導緻條帶模糊和缺失，也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

DNA的上樣

正确的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導緻DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導緻帶信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标準每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。

Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目标片段大小附近ladder較密的，這樣對目标片段大小的估計才比較準确。TIANGEN公司的DNAMarker條帶清晰，亮度均勻，質量穩定，是您實驗的首選。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作标準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預先65℃加熱5min，冰上冷卻後使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導緻的片段連接不規則或條帶信号弱等現象。

凝膠的染色和觀察

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是穩定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBRGreen，gelred，雖然毒性小，但價格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合适的光源和激發波長，如果激發波長不對，條帶則不易觀察，出現條帶模糊的現象。