凝胶电泳:胶体电泳-中文百科频道

基本原理

凝胶电泳的原理比较简单。当一种分子被放置在电场当中时 , 它们就会以一定的速度移向适当的电极 , 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 , 叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说 ,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多 ,其迁移的速度也就越快 , 反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质 , 如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等 , 从而降低了对流运动 , 故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数 , 因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异 , 以及所带的净电荷的多少 , 便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下 ,核酸分子的糖- 磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态 ,从这种意义上讲 ,D N A 和 R N A 多核苷酸链可叫做多聚阴离子 ( P ol yani o n s ) 。因此 , 当核酸分子被放置在电场中时 , 它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质 , 相同数量的双链 D N A 几乎具有等量的净电荷 , 因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下 , D N A 分子的这种迁移速度 , 亦即电泳的迁移率 , 取决于核酸分子本身的大小和构型 , 分子量较小的 D N A 分子比分子量较大的 D N A 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离 D N A 片段的基本原理。

决定因素

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：

DNA的分子大小

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

DNA分子的构象

DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。