指紋圖譜:标示生物化學特征的技術-中文百科頻道

分類

目前，中藥指紋圖譜技術已涉及衆多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認的三種常規分析手段。由于HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快、應用範圍廣等特點。中藥成分絕大多數可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，且積累較豐富的應用經驗。因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術的首選方法。随着HPLC—MS和GC—MS等聯用技術的應用，中藥指紋圖譜技術更趨完善。

中藥指紋圖譜質控技術是中藥質量标準現代化的突破口，将現代分析學的優秀成果與中醫藥整體綜合觀有機融合，有效地運用了全面質量管理的理念，能對中藥複雜體系特性作出科學的表達。可用于成品質量、工藝操作、原料材料的質量控制和監測，使其符合GAP的質量要求。這對企業的發展提高競争力是極為有利的，也是我們推行中藥指紋圖譜技術，提高中藥質量評價技術水平和科技含量，使其為國際社會所公認，實現與國際雙向接軌，擠身國際市場，把中藥産業做大做強的根本目的之所在。

研究概況

以指紋圖譜作為中藥（天然藥物）提取物及其制劑的質量控制方法，已成為目前國際共識，各種符合中藥（天然藥物）特色的指紋圖譜控制技術體系正在研究和建立。美國食品藥品管理局（FDA）允許草藥保健品申報資料中提供色譜指紋圖譜；世界衛生組織（WHO）在1996年草藥評價指導原則中也規定，如果草藥的活性成分不明确，可以提供色譜指紋圖譜以證明産品質量的一緻；歐共體在草藥質量指南中亦稱，單靠測定某種有效成分考查質量的穩定性是不夠的，因為草藥及其制劑是以整體為活性物質。色譜指紋圖譜尤其是薄層色譜的鮮明的指紋圖譜是很有用的。國外指紋圖譜的應用，目的在于解決成分複雜，有效成分不明确的植物藥質量檢測和産品批次間質量差異的問題。其中德國研制的銀杏葉提取物制劑是一個突出的例子。他們應用指紋圖譜制定了相應的标準，該圖譜體現了制劑所含的33個化學成分（主要為黃酮類和内酯類）和各自的含量。經化學成分和藥效相關性研究，發現約24%銀杏黃酮和約6%銀杏内酯組成的提取物具有最佳療效。此外，采用“混批勾兌”法，可使最終産品質量穩定，指紋圖譜重現性良好，含量浮動範圍為5%左右。

20世紀70年代我國已有學者嘗試使用TLCS對中成藥進行分析，因主客觀條件的限制，技術和時機的不成熟，沒有得到公認；20世紀90年代《中國藥典》增設了中藥化學對照品和對照藥材，為中藥指紋圖譜的研究奠定了基礎。随着色譜技術的迅速發展和檢測能力的顯着增強，為指紋圖譜的研究和應用提供了良好的技術保證。目前我國已對中藥注射劑做出了必須用指紋圖譜進行檢測的規定，同時提出了具體的技術要求；在中藥材規範化生産實施過程中指紋圖譜亦有較廣泛的應用。

但是作為一項新技術，中藥指紋圖譜在實際應用中還面臨許多問題，隻有進一步加強中藥材種植加工和中成藥生産貯存的規範化；中藥化學成分和中藥藥理研究的系統化和标準化；以及技術上多學科的滲透，才能保證中藥質量的穩定，進而保證中藥指紋圖譜的建立和實施。

随着指紋圖譜的發展，其能較好地解決目前中藥質量标準體系中存在的問題。指紋圖譜是基于對中藥物質群整體作用的認識，借助于波譜和色譜等技術獲得中藥化學成分的光譜或色譜圖的研究手段，是實現鑒别中藥真實性、評價質量一緻性和産品穩定性的可行模式。通過指紋圖譜可以獲得中藥中已知與未知成分的相對保留時間等信息，被譽為中藥的“化學條碼”。

分析

實驗目的

1. 掌握DNA指紋圖譜技術的概念、原理和基本操作過程

2. 學習DNA的限制性酶切的基本技術

3. 掌握瓊脂糖凝膠電泳的基本操作技術，學習利用瓊脂糖凝膠電泳測定DNA片段的長度，并能對實驗結果進行分析。

實驗原理

1984年英國萊斯特大學的遺傳學家Jefferys及其合作者首次将分離的人源小衛星DNA用作基因探針，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了由多個位點上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋極少有兩個人完全相同，故稱為"DNA指紋"，意思是它同人的指紋一樣是每個人所特有的。DNA指紋的圖像在X光膠片中呈一系列條紋，很像商品上的條形碼。DNA指紋圖譜，開創了檢測DNA多态性（生物的不同個體或不同種群在DNA結構上存在着差異）的多種多樣的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段長度多态性）分析、串聯重複序列分析、RAPD（随機擴增多态性DNA）分析等等。各種分析方法均以DNA的多态性為基礎，産生具有高度個體特異性的DNA指紋圖譜，由于DNA指紋圖譜具有高度的變異性和穩定的遺傳性，且仍按簡單的孟德爾方式遺傳，成為目前最具吸引力的遺傳标記。

DNA指紋具有下述特點：

1．高度的特異性：研究表明，兩個随機個體具有相同DNA圖形的概率僅3×10-11；如果同時用兩種探針進行比較，兩個個體完全相同的概率小于5×10-19。全世界人口約50億，即5×109。因此，除非是同卵雙生子女，否則幾乎不可能有兩個人的DNA指紋的圖形完全相同。2．穩定的遺傳性：DNA是人的遺傳物質，其特征是由父母遺傳的。分析發現，DNA指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都能在其雙親之一的圖譜中找到，這種帶紋符合經典的孟德爾遺傳規律，即雙方的特征平均傳遞50%給子代。3．體細胞穩定性：即同一個人的不同組織如血液、肌肉、毛發、精液等産生的DNA指紋圖形完全一緻。

1985年Jefferys博士首先将DNA指紋技術應用于法醫鑒定。1989年該技術獲美國國會批準作為正式法庭物證手段。我國警方利用DNA指紋技術已偵破了數千例疑難案件。DNA指紋技術具有許多傳統法醫檢查方法不具備的優點，如它可以從四年前的精斑、血迹樣品中，仍能提取出DNA來作分析；如果用線粒體DNA檢查，時間還将延長。此外千年古屍的鑒定，在俄國革命時期被處決沙皇尼古拉的遺骸，以及在前南地區的一次意外事故中機毀人亡的已故美國商務部長布朗及其随行人員的遺骸鑒定，都采用了DNA指紋技術。

此外，它在人類醫學中被用于個體鑒别、确定親緣關系、醫學診斷及尋找與疾病連鎖的遺傳标記；在動物進化學中可用于探明動物種群的起源及進化過程；在物種分類中，可用于區分不同物種，也有區分同一物種不同品系的潛力。在作物的基因定位及育種上也有非常廣泛的應用。

DNA指紋圖譜法的基本操作：

從生物樣品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可運用PCR技術擴增出高可變位點（如VNTR系統，串聯重複的小衛星DNA等）或者完整的基因組DNA，然後将擴增出的DNA酶切成DNA片斷，經瓊脂糖凝膠電泳，按分子量大小分離後，轉移至尼龍濾膜上，然後将已标記的小衛星DNA探針與膜上具有互補堿基序列的DNA片段雜交，用放射自顯影便可獲得DNA指紋圖譜。

瓊脂糖凝膠電泳是分離，鑒定和純化DNA片段的常規方法。利用低濃度的熒光嵌入染料-溴化乙錠進行染色，可确定DNA在凝膠中的位置。如有必要，還可以從凝膠中回收DNA條帶，用于各種克隆操作。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離範圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為200bp至近50kbp的DNA。長度100kb或更大的DNA，可以通過電場方向呈周期性變化的脈沖電場凝膠電泳進行分離。

在基因工程的常規操作中，瓊脂糖凝膠電泳應用最為廣泛。它通常采用水平電泳裝置，在強度和方向恒定的電場下進行電泳。DNA分子在凝膠緩沖液（一般為堿性）中帶負電荷，在電場中由負極向正極遷移。DNA分子遷移的速率受分子大小，構象。電場強度和方向，堿基組成，溫度和嵌入染料等因素的影響。