指纹图谱:标示生物化学特征的技术-中文百科频道

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目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和高效毛细管电泳法（HPCE）等色谱法以及紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点。中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC—MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。

中药指纹图谱质控技术是中药质量标准现代化的突破口，将现代分析学的优秀成果与中医药整体综合观有机融合，有效地运用了全面质量管理的理念，能对中药复杂体系特性作出科学的表达。可用于成品质量、工艺操作、原料材料的质量控制和监测，使其符合GAP的质量要求。这对企业的发展提高竞争力是极为有利的，也是我们推行中药指纹图谱技术，提高中药质量评价技术水平和科技含量，使其为国际社会所公认，实现与国际双向接轨，挤身国际市场，把中药产业做大做强的根本目的之所在。

研究概况

以指纹图谱作为中药（天然药物）提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，各种符合中药（天然药物）特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立。美国食品药品管理局（FDA）允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱；世界卫生组织（WHO）在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致；欧共体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。色谱指纹图谱尤其是薄层色谱的鲜明的指纹图谱是很有用的。国外指纹图谱的应用，目的在于解决成分复杂，有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。其中德国研制的银杏叶提取物制剂是一个突出的例子。他们应用指纹图谱制定了相应的标准，该图谱体现了制剂所含的33个化学成分（主要为黄酮类和内酯类）和各自的含量。经化学成分和药效相关性研究，发现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。此外，采用“混批勾兑”法，可使最终产品质量稳定，指纹图谱重现性良好，含量浮动范围为5%左右。

20世纪70年代我国已有学者尝试使用TLCS对中成药进行分析，因主客观条件的限制，技术和时机的不成熟，没有得到公认；20世纪90年代《中国药典》增设了中药化学对照品和对照药材，为中药指纹图谱的研究奠定了基础。随着色谱技术的迅速发展和检测能力的显着增强，为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证。目前我国已对中药注射剂做出了必须用指纹图谱进行检测的规定，同时提出了具体的技术要求；在中药材规范化生产实施过程中指纹图谱亦有较广泛的应用。

但是作为一项新技术，中药指纹图谱在实际应用中还面临许多问题，只有进一步加强中药材种植加工和中成药生产贮存的规范化；中药化学成分和中药药理研究的系统化和标准化；以及技术上多学科的渗透，才能保证中药质量的稳定，进而保证中药指纹图谱的建立和实施。

随着指纹图谱的发展，其能较好地解决目前中药质量标准体系中存在的问题。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图的研究手段，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式。通过指纹图谱可以获得中药中已知与未知成分的相对保留时间等信息，被誉为中药的“化学条码”。

分析

实验目的

1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程

2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术

3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。

实验原理

1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。

DNA指纹具有下述特点：

1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10-11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10-19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50%给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。

1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，如它可以从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。

此外，它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。

DNA指纹图谱法的基本操作：

从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。