凝膠電泳:膠體電泳-中文百科頻道

基本原理

凝膠電泳的原理比較簡單。當一種分子被放置在電場當中時 , 它們就會以一定的速度移向适當的電極 , 這種電泳分子在電場作用下的遷移速度 , 叫做電泳的遷移率。它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的淨電荷數成正比。也就是說 ,電場強度越大、電泳分子所攜帶的淨電荷數量越多 ,其遷移的速度也就越快 , 反之則較慢。由于在電泳中使用了一種無反應活性的穩定的支持介質 , 如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠等 , 從而降低了對流運動 , 故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數成反比的。已知摩擦系數是分子的大小、極性及介質粘度的函數 , 因此根據分子大小的不同、構成或形狀的差異 , 以及所帶的淨電荷的多少 , 便可以通過電泳将蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。在生理條件下 ,核酸分子的糖- 磷酸骨架中的磷酸基因呈離子狀态 ,從這種意義上講 ,D N A 和 R N A 多核苷酸鍊可叫做多聚陰離子 ( P ol yani o n s ) 。因此 , 當核酸分子被放置在電場中時 , 它們就會向正電極的方向遷移。由于糖- 磷酸骨架結構上的重複性質 , 相同數量的雙鍊 D N A 幾乎具有等量的淨電荷 , 因而它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下 , D N A 分子的這種遷移速度 , 亦即電泳的遷移率 , 取決于核酸分子本身的大小和構型 , 分子量較小的 D N A 分子比分子量較大的 D N A 分子遷移要快些。這就是應用凝膠電泳技術分離 D N A 片段的基本原理。

決定因素

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：

DNA的分子大小

線狀雙鍊DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

DNA分子的構象

DNA分子處于不同構象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關，還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而開環雙鍊DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以确定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上将DNA帶逐個回收，用同一種限制性内切酶分别水解，然後電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。